ショウジョウバエにおける腸内関連細菌のコロニー形成単位の定量化

要約

出典:Dodge、R.、et al.ショウジョウバエマイクロバイオームに適用した96ウェルプレートフォーマットでの高速コロニー形成ユニット計数J. Vis. 経験。(2023年)

このビデオは、ショ ウジョウバエ の腸内関連細菌のコロニー形成単位(CFU)を、連続希釈およびプレーティングアプローチを使用して定量化する方法を示しています。腸内細菌を含む均質化されたハエサンプルを連続的に希釈し、寒天にプレーティングし、コロニーの増殖を可能にするためにインキュベートします。次に、プレートの画像をソフトウェアを使用して分析し、各スポットのコロニーを整列、セグメント化、カウントし、正確なCFU定量化を可能にします。

プロトコル

1. 96ウェルPCRプレートでハエを個別に均質化する

1. ビーズビータープレートを事前に準備してください。
   1. 0.5 μmのガラスビーズ( 材料表を参照)をビーズ測定トレイに注ぎます。すべての井戸がいっぱいで水平になるようにビーズをトレイに広げ、余分なビーズを円錐形のチューブにブラシで落とし落として回収します。
   2. セミスカートポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プレート( 材料表を参照)を測定トレイに逆さまに置き、トレイのくぼみにはめ込んでウェルに合わせます。次に、すばやく裏返してビーズを移します。
   3. PCRプレート表面から余分なビーズを取り除き、ホイルで覆います。PCRプレートを検査して、すべてのウェルにビーズが含まれていることを確認します。必要に応じて、計量スクープを使用してビーズを1つのウェルに追加します。静電気によりプレート表面にビーズが付着する場合は、測定トレイとPCRプレートの背面を70%エタノールで拭くかスプレーしてください。
   4. アルミホイルで覆います。多くのプレートはこの方法で調製し、オートクレーブ滅菌して後で使用するために保管できます。使用する準備ができたら、96チャンネルピペッターを使用して100 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を各ウェルに加えます( 材料表を参照)。
2. 均質化する前に、微生物がコロニーを形成したハエを70%エタノールで表面滅菌します。
   1. ハエを100%CO₂ で5秒間麻酔します。小さな漏斗を使用して、麻酔したハエをバイアルから1.5 mLの微量遠心チューブに移します(図1A-2)。この研究では、通常、チューブごとに25匹のハエが追加されました。
   2. すぐに~1 mLの70%エタノールをチューブにスプレーし、チューブを閉じて、10秒間反転して混合します。次に、ハエを吸引しないように注意しながら、P1000ピペットでエタノールを吸引します。エタノールでもう一度繰り返し、次に滅菌PBSで2回繰り返します(図1A-3)。
3. 最後のPBS洗浄後、チューブを閉じ、キャップ側を下にしてベンチで数回強く叩き、ハエがキャップに入るようにします。
4. チューブを開き、鉗子を使用してハエをウェルに分配します(図1A-4)。各ウェルに1匹のフライを置きます(図1A-5)。ハエを麻酔し続けるために、積み込み中はプレートを氷の上に置いてください。
5. サーマルボンドヒートシールホイルを使用してプレートをシールします( 材料表を参照)。
   1. まず、ホイルシールの漏れを引き起こす可能性があるため、ウェルの近くにある浮遊ビーズをすべて取り除きます。ホイルのくすんだ面がプレート上で下向きになり、光沢のある面がヒートシーラーに向かって上を向いていることを確認してください。ヒートシーラー( 材料表を参照)を5秒間しっかりと押し下げます(図1A-6)。ハンドアプリケーターで磨き( 材料表を参照)ホイルを固定します。
      注:密閉不良はサンプル損失の原因です。
6. プレートをプレートシェーカーに固定します。5分間均質化します(図1A-7)。ミニプレートスピナー( 材料表を参照)でビードプレートを350 x g で30秒間回転させ、シーリングホイルから液体を取り除きます。
7. ハエの液滴が井戸から飛び散らないように、プレートを持ちながらホイルを取り外します。

2. フライホモジネートの連続希釈とCFUプレートへのスポッティング

1. 4つの長方形のデマン、ロゴサ、およびシャープ(MRS)寒天成長プレート( 材料表を参照)をバイオセーフティキャビネットに入れ、蓋を取り外します。このプロトコルでは、MRS寒天培地を L.プランタラムの増殖に使用した。これらのプレートを少なくとも10分間乾燥させます(注ぎたての場合、または保管から冷やした場合は20分)。
   注:プレートが濡れている場合、96ウェルプレートからの液滴が一緒に流れ、カウントが台無しになります。
2. 96チャンネルピペッターを使用して、滅菌96ウェルプレートの各ウェルに100 μLのPBSを加えて、3つの希釈プレートを調製します。P20チップのラックを96チャンネルピペッターにロードします。
3. セクション1で調製したサンプルプレートから11.1 μLのホモジネートを吸引して、1:10に希釈します(図1A-8)。ハエホモジネートとガラスビーズがピペットを詰まらせるため、ウェルの底ではなくウェルの真ん中から引き出してください。ビーズは沈み、ハエの微粒子は浮き上がり、中間層はほぼ透明になります。
4. 11.1 μLを、ウェルあたり100 μLの滅菌PBSがすでに含まれている最初の希釈プレートに分注します。希釈プレートをプレートシェーカーに10秒間、毎分600回転(rpm)で保持します。ピペッティングを上下に5サイクル繰り返して再度混合します。11.1 μLを最初の希釈プレートから2番目の希釈プレートに移し、次の2つの希釈プレートで混合ステップを繰り返します。
5. 希釈シリーズめっきは、以下のように行ってください。
   1. バイオセーフティキャビネットから成長プレートを取り出します。
   2. 最も希薄なプレートから始めて、96ウェルピペッターを使用して各ウェルから寒天プレートに2 μLをスポットします(図1A-9)。
      1. 寒天に刺さらないように注意しながら、ピペッターヘッドをプレートにゆっくりと下げます。プレートを注意深く調べ、すべてのスポットが分配されていることを確認します。ない場合は、手動で2 μLを適切な位置に追加します。液体の斑点が寒天にすぐに染み込み、一緒に流れないようにしてください。
      2. 斑点が一緒に走っている場合は、新しい寒天プレートのセットを長期間乾燥させ、斑点をやり直します。プレートの種類が複数ある場合(例:異なる培地や抗生物質を含む)、それらも見つけてください。残りの溶液を希釈プレートに戻し、次に高い濃度に進みます。
         注:希釈液をスポットする場合は、次の希釈液を5回混合して、ピペットチップの内容物から前の希釈液が除去されるようにします。希釈プレートは、コロニー数に影響を与えることなく、4°Cで>8時間保存できます。
6. 残りの希釈プレートについて、手順2.5で説明したようにプレーティングプロセスを繰り返し、元のホモジネートを含むプレートまで、最も希薄なものから最も濃縮されたものへと進行します。
7. すべての液体が寒天に吸収されたら、プレートを反転させてインキュベーターに入れます(図1A-10)。ショウジョウバエ由来のラクチプランティバチルスとアセトバクターの場合、MRS培地の最適温度は30°Cです。コロニーが最適なサイズに達するまでインキュベートします:コロニーは、コロニーをはっきりと見ることができるほど大きくありませんが、互いの成長を融合または妨げるほど大きくはありません(最適なサイズの定量化については、代表的な結果を参照してください)。
   注:最適な成長条件は菌株に依存し、経験的に決定する必要があります。ショウジョウバエ由来のLactiplantibacillusの場合、最適なインキュベーション時間はMRS寒天培地での26時間から30時間です。ショウジョウバエ由来のアセトバクターの場合、菌株にもよりますが、最適なインキュベーション時間はMRS上で30時間から48時間です。
8. インキュベーション後、必要に応じて、カウントの準備が整うまでプレートを4°Cで保存します。

3. コロニー形成単位(CFU)の定量化

1. 以下に詳述するように、プレートを撮影し、自動ソフトウェアを使用してコロニーをカウントすることにより、CFUを定量化します。プレートを4°Cで保存した場合は、まずプレートを室温に置いて、まぶしさを発生させるプレートに結露がないようにします。
2. プレートを論理的な順序で整理し、撮影中はその順序に保つと、ファイルに名前を付けやすくなります。すべてのプレートの左上隅に A1 が来るように、すべてのプレートの向きを合わせます。写真が取り違えないように、A1 コーナーに固有の ID を付けることをお勧めします。各希釈シリーズを順番に積み重ねます。
3. プレートの蓋を取り外し、A1 を正しい角に向けてステージにプレートを置きます。プレートフォトボックスは、これらのトレイプレートの撮影に最適化されており、蛍光コロニーを画像化するための照明とフィルターオプションが含まれています。
4. プレートを画像化します。カメラ( 材料表を参照)を手動設定で使用して、プレート間の露出レベルを一定にします。遠近法の歪みを最小限に抑えるために、焦点距離を長く設定することをお勧めします。リモートシャッターを使用して写真をキャプチャし、手ブレによるブレを最小限に抑えます。
5. 画像をコンピューターに転送し、実験名、培地の種類、希釈係数、その他の関連詳細を含む名前を変更します。一部のオペレーティングシステム( 材料表を参照)には、選択したファイルを右クリックすることで、Finderで便利なバッチ名前変更機能があります。

4. Count-On-Itスイートを使用した自動コロニーカウント

1. ImageJ 用に提供されている Croptacular プラグインを使用して画像をトリミングします。このプラグインは、画像をサブリージョンの整然とした配列に分割するのに役立ちます(例:96ウェルプレートの場合は8 x 12)。サブリージョンは個別にカウントされます。
   1. 定量化のために処理する画像をフォルダーに整理します。プレートを区別するファイル名を選択すると、これらのファイル名はカウントのセットごとに列のタイトルになります。このフォルダー内に、「cropped」と「receipts」という名前のサブフォルダーを作成します。
   2. Croptacularを起動し、[OK]をクリックしてトリミングを開始します。
      メモ: デフォルト設定が表示され、通常はそれで十分です。画像の解像度、照明、スポット サイズなどに応じて、基本パラメータを調整すると役立つ場合があります。
   3. 画像がすでにまっすぐな場合は、 スペースを押すだけです。それ以外の場合は、水平になるはずのエッジに沿って線を引いて、画像をまっすぐにします。それでも画像がまっすぐに表示されない場合は、必要な回数だけ線を描き直します。
   4. 次に、カウントを行う領域の境界ボックスを描きます。すべてのスポットがセル内に入るまで、サイズと比率を調整します。境界ボックスの外側にカーソルをドラッグして、グリッドを更新します。グリッドが正常に表示されたら、 スペースキーを押します。
   5. 次の画像が最初の画像と同じ角度に自動的に回転することを確認します。プラグインは、すべての写真が同じように配置されていることを前提としています。これが正しい場合は、 スペース を押して続行します。それ以外の場合は、以前と同じように画像をまっすぐにします。グリッドは、前の画像と同じ位置も呼び出します。必要に応じて調整し、 スペースキーを押します。
2. ImageJ用のCount-On-It:Gridironプラグインを使用して、プレート上のコロニーを列挙します。
   1. Gridiron > Count-On-It を起動します。 クロプタキュラーと同じグリッド設定を使用します。ユーザーは、フォルダー全体をバッチ処理したり、単一の画像を分析したり、現在の画像から開始したりできます。
   2. ピクセル強度の上限値と下限値に基づいてしきい値を設定します。すべてのコロニーを選択しながら、しきい値をできるだけ厳しくします。理想的には、選択したコロニーの間にある程度のスペースがありますが、ソフトウェアはブロブをある程度セグメント化することができます。しきい値が満足のいくらいになったら、[アクションが必要] ダイアログボックスの [OK ] をクリックします。
   3. 結果を調べるには、ズームインしてコロニー数を詳しく調べます。キャンセルをクリックすると、プラグインが中止されます。[ OK ] をクリックして続行します。
   4. 最初の画像で、最小コロニーサイズを変更するなど、セットアップメニューに進むか戻るかのオプションが指定されていることを確認します。バッチ処理を続行するには、[ OK] をクリックします。次に、領収書と結果のテーブルを保持するフォルダーを選択します。「receipts」フォルダを使用するか、新しいフォルダを作成します。
   5. 最初の画像の後、次の画像はデフォルトで前の設定と同じしきい値になります。[ OK ] をクリックして、これらの設定を使用するか、設定を調整します。写真に一成性があり、設定が正確である場合は、[アクションが必要]ダイアログボックスの[ OK ]をクリックします。
      注:バッチ内のすべての画像が完了すると、結果テーブルは領収書と同じフォルダーに自動的に保存されます。
   6. ソフトウェアによって生成された棚卸領収書を確認し、棚卸エラーを手動で修正します。ImageJ プラグインは統計的に正確ですが、エラーは発生します。領収書を証明して、外れ値を調べ、誤カウントを特定します。ソフトウェアは、CFU データを領収書と同じフォルダーに.csvファイルとして保存します。
3. ユーザーが好むソフトウェアを使用してデータを分析します。

結果

図1:コロニー形成アッセイは、96ウェルプレートフォーマットを使用して、数百匹の個々のハエのCFUを測定します。 (A)プロトコルのセクションで説明されているように、コロニー形成アッセイとハイスループット定量法の図の概要。(B)コロニー形成アッセイ後のハエにおける Lactiplantibacillus plantarum (Lp)の存在量は、ハイスループットCFU定量法を使用してさまざ...

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