金属応答性遺伝子の役割を研究するための金属制限細菌増殖アッセイ

要約

出典: Maurakis、S.、 et al。金属応答性遺伝子の特性化と宿主配位子からの金属獲得のための淋 菌 の金属制限増殖 J. Vis. 経験。(2020)。

このビデオでは、金属応答性遺伝子の役割を研究するための金属制限細菌増殖アッセイを示します。金属が枯渇した培地で増殖した野生型および変異細菌を金属リガンドでインキュベートし、プレートリーダーを使用して増殖を監視します。金属が枯渇した条件下では、野生型細菌は金属の取り込みと増殖を可能にする表面受容体を発現しますが、変異体にはこの受容体が欠けているため、増殖が制限されます。

プロトコル

1. Chelex 処理された Defined Medium (CDM) ストック溶液の調製

1. 原液I
   1. 塩化ナトリウムまたはNaCl(233.8 g)、硫酸カリウムまたはK₂SO₄ (40.0 g)、塩化アンモニウムまたはNH₄Cl(8.8 g)、リン酸水素二カリウムまたはK₂HPO₄ (13.9 g)、およびリン酸二水素一カリウムまたはKH₂PO₄ (10.9 g)を脱イオン水で1 Lの最終容量に混合します。
   2. 溶液をフィルター滅菌し、50 mLのコニカルチューブに分注します。
   3. -20°Cで保管してください。
2. 原液II
   1. チアミン塩酸またはHCl(0.2 g)、チアミンピロリン酸-Cl(0.05 g)、パントテン酸カルシウム(0.19 g)、およびビオチン(0.3 g)を50%(vol / vol)エタノールに混合して、最終容量1 Lにします。
   2. 50 mLのコニカルチューブに分注し、-20°Cで保存します。
3. 原液III
   1. L-アスパラギン酸(4.0 g)、L-グルタミン酸(10.4 g)、L-アルギニン(1.2 g)、グリシン(0.2 g)、L-セリン(0.4 g)、L-ロイシン(0.72 g)、L-イソロイシン(0.24 g)、L-バリン(0.48 g)、L-チロシン(0.56 g)、L-プロリン(0.4 g)、L-トリプトファン(0.64 g)、L-スレオニン(0.4 g)、L-フェニルアラニン(0.2 g)、L-アスパラギン-H₂O(0.2 g)、L-グルタミン(0.4 g)、L-ヒスチジン-HCl(0.2 g)、L-メチオニン(0.12 g)、L-アラニン(0.8 g)、 L-リジン(0.4 g)、および還元グルタチオン(0.36 g)を500 mLの脱イオン水中で調和させました。
   2. L-システイン(0.44 g)およびL-シスチン(0.28 g)を1 M HClの最小容量(~1 mL)に溶解し、上記のアミノ酸溶液に加えます。
   3. すべての粒子状物質が溶解するまで、10 N水酸化ナトリウム(NaOH)で溶液のpHを調整します。最終的なpHは10.0〜11.0になります。
   4. 脱イオン水で最終容量を1Lにします。
   5. 溶液をフィルター滅菌し、250 mLの容量に分注します。
   6. -20°Cで保管してください。
4. 原液 IV
   1. グルコース(200 g)を脱イオン水に溶解し、最終容量は1 Lになります。
      注:グルコースを溶解するために溶液を加熱する必要がある場合があります。
   2. 溶液をろ過滅菌し、50 mLのコニカルチューブに分注します。
   3. -20°Cで保管してください。
5. 原液V
   1. ヒポキサンチン(5.0 g)、ウラシル(5.0 g)、およびNaOH(4.0 g)を脱イオン水で混合して、最終容量は1 Lになります。
   2. ろ過、滅菌し、50 mLのコニカルチューブに分注します。
   3. -20°Cで保管してください。
6. ソリューションVI
   1. 脱イオン水中で1 M塩化カルシウム二水和物またはCaCl_{2-2H 2}O(147 g / L)溶液を調製します。フィルター滅菌し、室温(RT)で保管します。
7. 原液 VII
   1. 脱イオン水中で1 Mの無水硫酸マグネシウム(MgSO₄)溶液を調製します。フィルター滅菌し、RTで保存します。
8. 原液VIII
   1. 脱イオン水中で1 Mの重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)溶液を調製します。フィルター滅菌し、RTで保存します。

2. 4x 滅菌濃縮物と 1x CDM の調製

注:この手順は、溶液への金属の浸出を防ぐために、酸処理された滅菌ガラス器具またはプラスチックのいずれかで実行されます。

1. ストック溶液I(50 mL)、II(20 mL)、III(250 mL)、IV(50 mL)、およびV(20 mL)を20.0 gの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)と混ぜ合わせ、攪拌して混合します。
2. pHを7.4に調整し、脱イオン水で最終容量を500mLにします。
3. Chelex-100 樹脂を 1 L の脱イオン水で洗浄して防腐剤を除去してから、4 倍滅菌濃縮液に加えます。これを行うには、1 Lの脱イオン水に50 gの樹脂を加え、少なくとも1時間攪拌します。真空ろ過で水を除去し、この洗浄した樹脂を手順2.4に使用します。
4. 樹脂50gを加え、ちょうど90分間ゆっくりとかき混ぜます。
5. フィルター滅菌により樹脂を除去し、4倍滅菌濃縮液を4°Cで保存します。
6. 1x作業濃度のCDMを調製するには、まず4x濃縮液を滅菌脱イオン水で希釈し、次に溶液VI(1x溶液500mLあたり125 μL)、溶液VII(500 mLあたり535 μL)、および溶液VIII(500 mLあたり10 mL)を加えます。
   注:すべてのストック溶液はすでに滅菌されていますが、調製後に1x溶液を再度ろ過滅菌することをお勧めします。

3. CDMプレートの調製

注:以下のレシピでは、プレート用の培地を1 L作りますが、これらを少量で準備するのが最善です。すべてが比例して縮小されます。

1. 洗浄アガロース
   1. 50 gのアガロースを1 Lの脱イオン水に溶解し、1時間攪拌します。
   2. 溶液を遠心分離機ボトルに移し、RTで1,200 x g で15分間遠心分離します。上清を慎重に注ぎ、廃棄します。
   3. アガロースペレットを再懸濁させるのに十分な脱イオン水を加え、1 Lフラスコに移します。脱イオン水で最終容量を1 Lにし、手順3.1.2のように攪拌して遠心分離します。上清を捨てます。
   4. ペレットを再懸濁するのに十分な100%エタノールを加え、新しい1 Lフラスコに移します。エタノールで最終容量を1Lにします。手順3.1.2のように攪拌して遠心分離します。
   5. 手順 3.1.4 を繰り返します。
   6. メタノールをアガロースペレットに加えて再懸濁させ、1 Lフラスコに移します。メタノールで最終容量を1 Lにします。手順3.1.2のように攪拌して遠心分離します。
   7. 手順 3.1.6 を繰り返します。
   8. 洗浄したアガロースをアルミホイルで裏打ちされたトレイに移し、ヒュームフードで乾燥させます。乾燥したら、金属を含まない容器に移して長期保存してください。
2. 洗浄したアガロース10gと片栗粉5gを750mLの脱イオン水に加えます。
3. オートクレーブで121°C、大気圧より100kPa高い30分間。
4. 培地を~65°Cに冷却してから、250 mLの4X CDM、250 μLのVI溶液、1.07 mLのVII溶液、および20 mLのVIII溶液を加えます。
5. 必要に応じて、プレートを注ぐ前に選択した金属を追加します。キレート剤の添加は、金属を含まない状態を維持するために必要ありません。
6. シャーレに注ぎ、固めます。

4. 淋菌の金属の限られた成長

注:ほとんどのアプリケーションでは、CDMを接種する前に細菌に金属ストレスを与える必要はありません。CDMの最初の倍増ステップとその後の希釈は、淋菌の内部鉄と亜鉛貯蔵を枯渇させるのに十分です。そのため、次の手順の最初の2つのステップは、ケロッグのサプリメントIと12.5μM硝酸第二鉄(Fe(NO₃)₃)を添加したゴノコッカス(GC)培地ベースから作られた寒天プレートを使用して実行されます。早期の金属応力が必要な場合は、Fe(NO₃)₃ を含まず、亜鉛キレート化用に5 μM TPEN(N,N,N',N'-テトラキス(2-ピリジルメチル)エチレンジアミン)または鉄キレート化用に10 μMデフェロキサミンを含むGC媒体ベースプレートを調製することをお勧めします。すべてのインキュベーションは、5%CO₂で37°Cで行われます。

1. 実験の2日前の-2日目に、冷凍庫のストックから淋菌をGC培地プレートにストリークし、24時間以内にインキュベートします。
2. -1日目に、単一のコロニーを新鮮なGC培地プレートにストリークします。成長実験の14〜16時間前にこれを行うようにしてください。
3. 実験当日、酸洗浄した125 mLバッフルサイドアームフラスコに5〜10 mL 1x CDMを加え、これを使用してKlett比色計をブランクします。
4. 滅菌済みの綿棒を使用して、健康な単一コロニーからCDMを接種します。クレット20台を狙う。
   注:Klett比色計が利用できない場合は、分光光度計も適しています。クレット単位からODへの普遍的な変換式はありませんが、大まかなガイドが利用可能です(https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales)。
5. 250 rpmで振とうしながら、約1質量が倍増するまでインキュベートします(40クレットユニット)。これには1〜2時間かかります。
6. この時点で、培養物は、初期培養密度の半分に達するのに十分な量のCDMを添加することによって逆希釈されます(たとえば、5 mLの培養物が20から40クレット単位になった場合、15 mLのCDMはそれを10クレット単位に戻します)、ステップ4.5のように成長を継続します。逆希釈、金属処理などの具体的な量は、下流の用途によって異なります。以下に3つの例を示します

5. 金属制限成長アッセイ

注:これらのアッセイは、既製の成長プレミックスを記述します。これらの混合物の調製については、セクション6で説明します。

1. ステップ4.5の質量倍増中に、96ウェルマイクロプレートのウェルを10xプレミックスで前処理します。さらに、ブランクとして機能する 3 つのウェルを指定します。これらのウェルに、10 μLの10xプレミックスと90 μLのCDMを加えます。
2. サイドアームフラスコ内の培養物が2倍になったら、各培養物100 μLをマイクロプレート内の未使用ウェルに加え、600 nm(OD600)での光学密度を測定します。これは分光光度計のキュベットで行うことができますが、アッセイ内のひずみの数が多いと、これは面倒になる可能性があり、分光光度計がサイドアームフラスコのアームから直接測定できない限り、一般的にはお勧めできません。
   1. ODを測定している間、フラスコをインキュベーターに戻して、淋菌が生存し続けることを確認します。
3. 培養物をOD600 = 0.02にするために必要な正しい希釈量を計算します。10倍のプレミックスはODへの影響はごくわずかであり、計算から省略できます。
4. 小さな培養チューブで培養物をCDMで希釈し、プレート内で10倍のプレミックスを1倍に希釈するのに十分な量を追加します。プレートウォーマーが利用可能な場合は、作業中はプレートを37°Cに保ちます。
5. プレートリーダーで振とうしながらプレートを8〜12時間インキュベートし、所望の間隔でOD600測定を行います。

6. トランスフェリン、S100A7、カルプロテクチンの金属負荷、および10xプレミックスの調製

注:CDM調製と同様に、溶液調製には酸洗浄ガラスまたはプラスチックを使用してください。

1. ヒトトランスフェリンを初期バッファー(100 mM Tris、150 mM NaCl、20 mM NaHCO₃、pH = 8.4)に10 mg / mL(125 μM)で溶解します。S100A7およびカルプロテクチンは、20 mM Tris、100 mM NaCl、10 mM 2-メルカプトエタノール、および1 mM塩化カルシウムまたはCaCl₂、pH = 8.0からなる緩衝液に懸濁されます。
   1. フェレーション溶液(100 mMクエン酸ナトリウム、100 mM NaHCO₃、5 mM塩化鉄(III)六水和物またはFeCl 3-6H₂O、pH = 8.4)をトランスフェリン溶液に加えて、30%の鉄飽和度を達成します(たとえば、10 mg / mLで作った場合、75 μLのフェレーション溶液は5 mLのトランスフェリンに適しています)。
   2. 硫酸亜鉛(ZnSO₄)をS100A7またはカルプロテクチンにタンパク質に対して50%のモル比で添加して、25%の飽和度を作り出します(各タンパク質分子には2つの金属結合部位があります)。100 μM S100A7またはカルプロテクチンと50 μM ZnSO₄ の調製を使用できます。
   3. どちらの場合も、金属の負荷のために少なくとも1時間エンドオーバーエンドの混合を許可します。
2. 4 Lの透析バッファー(40 mM Tris、150 mM NaCl、20 mM NaHCO₃、pH = 7.4)を調製します。これを2つの別々の2 L容量に分割し、1つを4°Cに置きます。
3. シリンジを使用して金属を充填したタンパク質を透析カセットに加え、RTで最初のバッファー容量に対して4時間透析します。
4. カセットを2番目のバッファー容量に移動し、4°Cで一晩透析します。これらの手順の後、結合していない金属をすべて除去する必要があります。
   注:透析後のタンパク質濃度を決定するために、ビシンコニン酸アッセイをお勧めします。
5. トランスフェリンの利用には、唯一の鉄源としてトランスフェリンの利用に 10 倍のトランスフェリン プレミックスを使用します。
   1. このプレミックスを、30%ヒトFe-トランスフェリンおよびウシアポ-トランスフェリン(ヒトトランスフェリンについて記載されているように125 μMで調製し、鉄負荷ステップなしで調製)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でそれぞれ75 μMおよび30 μMに希釈することにより調製します。ポジティブコントロールプレミックスは、30%のFe-トランスフェリンを75μMのFe(NO)₃に置き換え、ネガティブコントロールプレミックスは、添加された鉄を省略し、ウシのアポトランスフェリンのみを保持します。増殖アッセイでは、これらの濃縮物10 μLを90 μLの培養物で希釈します。最終濃度は、7.5 μM、30%ヒトFeトランスフェリン、および3 μMウシアポトランスフェリンです。
6. S100A7またはカルプロテクチンの利用には、トランスフェリン10xプレミックスの改良版を唯一の亜鉛源として使用してください。
   1. ポジティブコントロールプレミックスの場合は、50 μM ZnSO₄ をトランスフェリンプレミックスに組み込みます。ネガティブコントロールの場合は、50 μM TPENを組み込み、亜鉛を省略します。次に、必要なサンプルごとにこれらをそれぞれ10 μL取り、その容量を新しいチューブに移動します。これに半分の量の滅菌PBSを追加します。たとえば、10ウェルがポジティブコントロールプレミックスを受け取る場合、100 μLのプレミックスを取り、新しいチューブに移動し、50 μLのPBSを追加します。ネガティブコントロールについても同じことを行います。
   2. S100A7またはカルプロテクチンプレミックスを作るには、必要なウェルごとに10 μLのネガティブコントロールプレミックスを取り、新しいチューブに移動し、その半分の量の25%Zn-S100A7またはカルプロテクチンを加えます。増殖アッセイでは、15 μLのプレミックスを使用し、85 μLの培養物で希釈します。トランスフェリンの最終濃度は、ステップ8.5と同じままで、5 μMのZn、TPEN、またはS100A7 /カルプロテクチンを添加します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
125 mLサイドアームフラスコ	ベルコ	2578-S0030	カスタムオーダーする必要があります
2-メルカプトエタノール	VWRの	M131	ヒュームフードで開く
3MM紙	GEヘルス	3030-6461	本文では「ろ紙」と呼ばれます
アガロース	バイオローン	バイオ-41025	粉
塩化アンモニウム	シグマ・アルドリッチ	A9434	粉
ウシトランスフェリン	シグマ・アルドリッチ	T1428	粉
塩化カルシウム二水和物	シグマ・アルドリッチ	C5080	粉
パントテン酸カルシウム	シグマ・アルドリッチ	C8731	粉
カルプロテクチン	該当なし	該当なし	これは協力者から提供されています
Chelex-100樹脂	バイオラッド	142-2832	使用前に脱イオン水で洗ってください
綿先の滅菌綿棒	ピューリタン	25-806	この用途では、綿はポリエステルよりも優れています
デフェロキサミン	シグマ・アルドリッチ	D9533	粉
D-グルコース	シグマ・アルドリッチ	G8270	粉
透析用カセット	熱	66380	使用前にバッファーに事前に浸してください
エタノール	コプテック	V1016	可燃性液体、可燃性キャビネットに保管
塩化第二鉄	シグマ・アルドリッチ	F7134	刺激性、吸入しないでください
硝酸第二鉄非水和物	シグマ・アルドリッチ	F1143	刺激性、吸入しないでください
GC培地ベース	ディフコ	228950	粉末、すでに寒天が含まれています
グリシン	シグマ・アルドリッチ	G8898	粉
ヘペス	漁夫	L-15694	粉
ヒトトランスフェリン	シグマ・アルドリッチ	T2030	粉
ヒポキサンチン	シグマ・アルドリッチ	H9377	粉
クレット比色計	マノスタット	37012-0000	色透過率を使用して培養密度を評価
L-アラニン	シグマ・アルドリッチ	A7627	粉
L-アルギニン	シグマ・アルドリッチ	A5006	粉
L-アスパラギン一水和物	シグマ・アルドリッチ	A8381	粉
L-アスパラギン酸	シグマ・アルドリッチ	A9256	粉
L-システイン塩酸塩	シグマ・アルドリッチ	C1276	粉
L-シスチン	シグマ・アルドリッチ	C8755	粉
L-グルタミン酸	シグマ・アルドリッチ	G1251	粉
L-グルタミン	シグマ・アルドリッチ	G3126	粉
L-ヒスチジン一塩酸塩	シグマ・アルドリッチ	H8125	粉
L-イソロイシン	シグマ・アルドリッチ	I2752	粉
L-ロイシン	シグマ・アルドリッチ	L8000	粉
L-リジン	シグマ・アルドリッチ	L5501型	粉
L-メチオニン	シグマ・アルドリッチ	M9625	粉
L-フェニルアラニン	シグマ・アルドリッチ	P2126	粉
L-プロリン	シグマ・アルドリッチ	P0380	粉
L-セリン	シグマ・アルドリッチ	S4500	粉
L-スレオニン	シグマ・アルドリッチ	T8625	粉
L-トリプトファン	シグマ・アルドリッチ	T0254	粉
L-チロシン	シグマ・アルドリッチ	T3754	粉
L-バリン	シグマ・アルドリッチ	V0500	粉
硫酸マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	M7506	粉
メタノール	VWRの	BDH1135-4LP	可燃性液体、可燃性キャビネットに保管
リン酸二塩基性カリウム	シグマ・アルドリッチ	60356	粉
リン酸カリウム一塩基性	シグマ・アルドリッチ	P9791	粉
硫酸カリウム	シグマ・アルドリッチ	P0772	粉
片栗粉	シグマ・アルドリッチ	S4251	粉
還元グルタチオン	シグマ・アルドリッチ	G4251	慎重に取り扱ってください。酸化しやすい。
S100A7	該当なし	該当なし	これは協力者から提供されています
炭酸水素ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S5761	粉
塩化ナトリウム	VWRの	470302	粉
クエン酸ナトリウム	漁夫	S279	粉
水酸化ナトリウム	アクロスオーガニック	383040010	吸湿性が高い
チアミン塩酸塩	シグマ・アルドリッチ	T4625	粉
チアミンピロリン酸	シグマ・アルドリッチ	C8754	コカルボキシラーゼとも呼ばれます
TPEN	シグマ・アルドリッチ	P4413	粉
トリス	VWRの	497	粉
ウラシル	シグマ・アルドリッチ	U0750	粉
亜鉛硫酸七水和物	シグマ・アルドリッチ	204986	刺激性、吸入しないでください