ドットブロ ットを用いた淋 菌における表面金属輸送体の検出

この記事について

要約

このビデオでは、リガンド結合、抗体検出、比色可視化を含むドットブロットアッセイを使用して、金属制限条件下で増殖した淋菌の表面金属トランスポーターを検出する手順を示します。

プロトコル

1. 外膜金属トランスポーターによるリガンド結合の検出

培養物を3容量のCDM(chelex処理された定義培地)で逆希釈します。
次に、4時間振とうしながらインキュベートします。
4時間マークの直前に、3枚のろ紙と1枚のニトロセルロースを、ドットブロット装置に収まるのに必要なおおよそのサイズにカットします。ニトロセルロースを脱イオン水に予め浸し、ニトロセルロースの下のろ紙で装置を組み立てます。
4時間で、細胞密度を記録し、適切な最終密度に標準化します。
細胞培養物をニトロセルロースにピペットで移し、ろ紙がすべての液体を吸収するのに十分な時間を確保します。
装置を分解し、ブロットを乾燥させ、トリス緩衝生理食塩水中の5%ウシ血清アルブミンまたは脱脂乳(w / v)でニトロセルロース膜を1時間ブロックします。
ドットブロット装置を再組み立てし、濾紙をパラフィンフィルムに交換して、ニトロセルロースの下に漏れ防止シールを作成します。
目的の金属結合リガンドをブロッカーおよびプローブ細胞で0.2μMに1時間希釈します。
真空で液体を吸い取り、ブロットを洗浄し、標準的な免疫学的手順に従ってシグナルを発生させます。洗浄ステップは、装置の内外で行うことができます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前	会社	カタログ番号	コメント
125 mLサイドアームフラスコ	ベルコ	2578-S0030	カスタムオーダーする必要があります
2-メルカプトエタノール	VWRの	M131	ヒュームフードで開く
3MM紙	GEヘルス	3030-6461	本文では「ろ紙」と呼ばれます
ブロッティンググレードブロッカー	バイオラッド	170-6404	無脂肪粉乳
ウシ血清アルブミン	ロシュ	3116964001	粉
カルプロテクチン	該当なし	該当なし	これは協力者から提供されています
Chelex-100樹脂	バイオラッド	142-2832	使用前に脱イオン水で洗ってください
綿先の滅菌綿棒	ピューリタン	25-806	この用途では、綿はポリエステルよりも優れています
ドットブロット装置	シュライヒャー&シュウェル	10484138	サンプルを投入する前に、蓋をできるだけしっかりとロックしてください
エタノール	コプテック	V1016	可燃性液体、可燃性キャビネットに保管
クレット比色計	マノスタット	37012-0000	色透過率を使用して培養密度を評価
メタノール	VWRの	BDH1135-4LP	可燃性液体、可燃性キャビネットに保管
ニトロセルロース	GEヘルス	10600002	使用するまで保護シースに入れて保管してください
S100A7	該当なし	該当なし	これは協力者から提供されています
塩化ナトリウム	VWRの	470302	粉
トリス	VWRの	497	粉

ドットブロットを用いた淋菌における表面金属輸送体の検出