GFP/ルシフェラーゼレポーターシステムを用いた Mycobacterium smegmatis の誤翻訳率の測定

要約

出典: Chen、Y.、 et al.、機能獲得レポーターシステムによる特定のマイコバクテリア誤翻訳率の測定。 J. Vis. 経験。 (2019年)

このビデオでは、誘導性GFPと分泌変異ルシフェラーゼレポーターシステムを使用して、 Mycobacterium smegmatis の誤翻訳を定量する方法を示します。誤翻訳による発光を測定し、GFP蛍光と比較して、翻訳精度に対する試験分子の影響を評価する方法を示します。

プロトコル

1. ナノルックルシフェラーゼ(Nluc)/緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター

手記： この方法の視覚的な表現については、 図 1 を参照してください。

1. -80°Cストックの細菌レポーター株に2 mLの7H9培地を接種します。OD₆₀₀ が固定相(OD >3)に達するまで、37°Cで1〜2日間振とうします。
2. 50 mLの7H9培地に継代培養し、OD₆₀₀ が後期固定期に達するまで成長させます(>4)。
3. 細菌を96ウェルプレートに分注する前に、最終濃度50 ng / mLのアンヒドロテトラサイクリン(ATC)を加え、よく混合します。バルク培養の誘導により、すべてのウェルに同じ量の誘導剤が含まれ、レポーターの誘導が同期することが保証されます。細菌を透明な丸底の96ウェルプレートに分注し、各ウェルに100 μLの容量を入れます。
4. 誤翻訳率に影響を与える小分子をスクリーニングするには、指定された濃度で化合物を添加してウェルを選択します。このプロトコルの目的のために、カスガマイシン( 図2に示された用量)を例として使用します。異なる用量のカスガマイシンをウェルを選択して追加します(各実験グループには少なくとも2つの生物学的複製が含まれている必要があります)。
5. サンプルを37°Cで16〜20時間振とうして誘導します。
   手記： プレートをフィルムで密封する必要があります。また、テストウェルからの蒸発を制限するために、すべてのエッジウェルに少なくとも200μLの滅菌水を充填する必要があります。
6. マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから80 μLを取り出し、サンプルを黒色の96ウェルプレートに移します(これにより、蛍光シグナル測定が最大化されます)。GFP信号を光度計で20msの積分時間で測定します。
7. GFPシグナルを測定した後、プレートを3,220 x g で10分間遠心分離します。50 μLの上清を白底の96ウェルプレートに移し(これにより、発光シグナル測定が最大化されます)、各ウェルに50 μLのNluc基質を加え、それらをよく混合し、1,000 msを積分時間としてルミノメーターで測定します。
8. 補正されたNluc発光値をGFP蛍光で割ることにより、Nluc / GFP比を決定します:この測定値(任意の単位)は、アスパラギンの誤訳に対するアスパラギン酸の相対的な測定値です。

結果

図1:誤翻訳率Nluc-GFPレポーターの測定概要。 NlucおよびGFPレポーターで形質転換した M.smegmatisの新鮮な培養物を、テストするすべてのプレートに十分な容量まで増殖させます(~10 mL / 96ウェルプレートを想定)。細菌培養物を各ウェルにピペッティングする直前に、バルク培養物にATCを添加してレポーターの発現を誘導します。ウェルを一晩振ってインキュベートします。相対的な誤翻訳率を測定するには、培養物を黒色プレートに移し(蛍光検出の感度を高めるた...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ミドルブルック 7H9	BDディフコ	271310
アンヒドロテトラサイクリン	ケイマンケミカル	10009542
春日マイシン	シグマ	K4013
Nano-Gloルシフェラーゼアッセイ	プロメガ	N1120
Fluoroskan Ascent FLルミノメーター	熱	/
アッセイプレート、96ウェルホワイト、フラットボトムハイバインディング、蓋なし	コスター	3922
アッセイプレート、96ウェルブラック、フラットボトムハイビディング、蓋なし	コスター	3925
96ウェル細胞培養クラスター、蓋付き平底	コスター	3599
pUV-TetOR-Ag85Aec-Nluc-D140N	NA	NA	変異Nlucルシフェラーゼのテトラサイクリン誘導性分泌型を有するエピソームシャトルプラスミド
pMC1S-GFP型	NA	NA	GFPのテトラサイクリン誘導発現のための抗酸菌統合(L5部位)ベクター