シアノバクテリア培養同期と明暗サイクルによるDNA圧縮

要約

出典: Murata, K. et al., Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography. J. Vis. 経験。 (2018年)

このビデオでは、概日調節DNA圧縮を研究するために、明暗サイクル下でのシアノバクテリアの同期培養を示します。蛍光顕微鏡は、定義された時点で凝縮されたDNAを明らかにし、集団全体の細胞周期の調整を確認します。

プロトコル

1. シアノバクテリアの同時培養

1. 1.5%(w / v)寒天と0.3%(w / v)チオ硫酸ナトリウムを含む滅菌青緑色培地11(BG 11)プレート(9 cm滅菌プラスチックシャーレ内)で Synechococcus elongatus PCC 7942を培養します。
2. プレートを23°Cの増殖チャンバーに50μE/^{m 2}/sの光強度で置き、12時間の光/12時間の暗サイクルにさらします。
3. 週に一度、細胞を新鮮なBG11寒天プレートに移します。
   手記： 寒天培地の培養物は、これらの培養条件下で1週間後に活発に増殖する細胞の緑色の帯として現れます。
4. 火炎滅菌されたワイヤーループで細胞の緑色の塊を取り、細胞を新鮮なBG11寒天プレートに縞模様で描きます。クリーンベンチで行ってください。

2. 蛍光顕微鏡によるモニタリング

1. 寒天プレート上で6日間培養した細胞を使用して、DNAの圧縮を観察します。1mLの0.2 Mスクロース溶液を細胞に注ぎ、光期間の終わりにプレートから細胞を収集します。ほとんどの細胞が集められるように、溶液を細胞に注ぐことを繰り返します。浮遊細胞溶液をマイクロチューブに移してDNA染色します。
2. DNA染色色素(例: Hoechst 33342)溶液をマイクロチューブ内の500 μLの懸濁細胞溶液に最終濃度1 μg/mLまで加えます。次に、チューブを暗所に10分間置きます。
3. 2,000 x g で1分間遠心分離して細胞を沈殿させます。上清を廃棄し、10 μLの0.2 Mスクロース溶液を加えて、高密度の細胞懸濁液を得る。
4. 染色細胞を含む溶液1 μLをスライドガラスに移し、カバースリップを置き、倍率100倍の対物レンズと浸漬油を使用して、紫外線(UV)フィルターを備えた蛍光顕微鏡で観察します。
5. この時点でほとんどの細胞でDNA圧縮が観察されることを確認します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Hoechst 33342 ソリューション	道珍島	346-07951	水中で1mg/mL
寒天粉末(植物培養用)	和光	016-11875
ホウ酸	和光	027-02192
塩化マンガン四水和物	和光	139-00722
硫酸亜鉛七水和物	和光	264-00405
モリブデン酸ナトリウム	和光	196-02472
硫酸銅五水和物	和光	039-04412
硝酸コバルト六水和物	和光	031-03752
硝酸ナトリウム	和光	191-02542
硫酸マグネシウム七水和物	和光	131-00405
塩化カルシウム脱水物	和光	031-00435
クエン酸	和光	036-05522
EDTA-2Na	道珍島	343-01861
炭酸ナトリウム	和光	197-01581
リン酸二塩基性カリウム	和光	164-04295
TES(グッドのバッファー)	道珍島	344-02653
クエン酸第二鉄アンモニウム	和光	092-00802
チオ硫酸ナトリウム五水和物	和光	197-03585
蛍光顕微鏡	ニコン	エクリプス 50i