無細胞系を用いたナノディスク安定化膜タンパク質抗原の合成

要約

出典: Gilmore、SF、 et al。ワクチン開発のための Chlamydia muridarum 由来の組換え主要外膜蛋白質への無細胞スケール生産とアジュバント添加 J. Vis. 経験。(2022年)

このビデオは、デュアルコンパートメントシステムを使用したナノディスク安定化膜タンパク質抗原の無細胞合成を示しています。このデバイスは、効率的なタンパク質合成、適切な折り畳み、ナノディスクへの安定した統合のための最適な条件を維持します。

プロトコル

サブユニットワクチン製剤用の主要外膜タンパク質-テロデンドリマーナノリポタンパク質粒子(MOMP-tNLP)の無細胞生産

1. 無細胞法を使用してMOMP-tNLPを調製します。
   1. 無細胞反応を設定する2時間前に、原核生物の無細胞タンパク質発現キットを開き、再構成バッファーの1つを解凍します。解凍したら、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含まないプロテアーゼ阻害剤カクテルを1錠加え、完全に溶解させます。

2. 5 x 1 mL反応を実行するように設計されたキットを使用して、このプロトコルに従います。

   手記： 一般的なスケールアップ生産は 3 x 1 mL です。

   1. 1 mL反応ごとに、525 μLの再構成バッファーを大 腸菌 ライセートボトルに加え、穏やかに転がして溶解させます。反応添加剤(アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸など)を含むボトルに250 μLの再構成バッファーを加え、穏やかに転がして溶解します。
   2. 反応フィードボトルに8.1mLの再構成バッファーを加え、ゴム栓でキャップし(ゴム栓の内側に触れないように注意)、軽く反転/転がして溶解させます。
   3. アミノ酸混合物ボトルに3 mLの再構成バッファーを加え、ゴム栓でキャップをし、静かに反転/転がして溶解させます。
      手記： ゴム栓の内側に触れると、汚れの原因となりますのでご注意ください。
   4. メチオニンボトルに1.8 mLの再構成バッファーを加え、穏やかに転がして溶解させ、使用するまで氷上で保存します。
       
3. 反応溶液を調製します。
   1. 大 腸菌 ライセートボトルに、225 μLの再構成反応ミックス、270 μLのメチオニンを含まない再構成アミノ酸ミックス、および30 μLの再構成メチオニンを加えます。さらに、400 μLの1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)/テロデンドリマー混合物、15 μgのMOMPプラスミド、および0.6 μgのΔ49アポリポタンパク質A1プラスミドを加えます。転がしたり、軽く振ったりして混ぜます。
      手記： 両方のプラスミドが同じプラスミドバックボーンから構築されていることを確認してください。渦を巻かないでください。
   2. 総溶液20 μLを取り、グリーン蛍光タンパク質(GFP)発現コントロール反応用に1.5 mLチューブに入れます(以下を参照)。
       
4. 飼料溶液を準備します。飼料ミックスボトルに、メチオニンを含まない再構成アミノ酸ミックス2.65 mLと再構成メチオニン300 μLを加えます。転がしたり、軽く振って溶かします。
   手記： このとき、未使用の再構成バッファーとメチオニンを冷凍庫に戻して保管することができます。
    
5. 反応溶液1 mLを無細胞反応キットに付属の内部反応チャンバーに移し、充填したら密封します。10 mLの供給溶液を反応容器の外室に移し、密封します。
   手記： チャンバーをいっぱいにしすぎないでください!内部反応チャンバーと内部供給チャンバーの両方の上部に気泡が存在すると、反応に悪影響を及ぼします。残りの反応溶液を1.5mLチューブに入れ、メイン容器と一緒に混合することができます。
    
6. 0.5 μLのGFPコントロールプラスミド(0.5 mg/mL)を、前述的に分注した20 μL反応混合物に加えます。
   手記： 多くのキットには、品質管理の目的でコントロールプラスミドが付属しています。T7プロモーターと大 腸菌 リボソーム結合部位(RBS)を持つほとんどのGFP発現プラスミドは、コントロールプラスミドとしても使用できます。
    
7. 反応を300 rpm、30°Cのシェーカーに最大18時間置きます。反応が成功したことを確認するには、わずか15分間のインキュベーション後にUV光源を使用して、コントロールGFP (図1) の合成による蛍光を確認します。
   手記： これらの条件、特に温度は、他の膜タンパク質の発現のために最適化する必要がある場合があります。

結果

図1:MOMP-tNLPの発現と精製。(A)GFPプラスミドを含まないライセート(左)と比較して、UV光源下で発光するGFPコントロールを発現することに成功した無細胞反応の小さなアリコートを含むチューブの画像(右)。(B)SDS-PAGE後にSYPRO Rubyで染色したプロテインゲルは、MOMP-tNLPの精製プロファイルを示しています。MOMPは40 kDaで移動し、Δ49アポリポタンパク質...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
粉末としての1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)	アバンティ ポーラー リピッド	850345
1.5 mLエンドトキシンフリー遠心分離チューブ	エッペンドルフ	2600028
C24 インキュベーターシェーカー	ニューブランズウィックサイエンティフィック
無細胞発現システム:RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit	バイオテックウサギ	BR1400201
cOmplete、EDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ分子診断	4693132001
オービタルシェーカー
PEG5K-CA8 テロデンドリマー(カスタム合成品)
pIVEX2.4dベクター	ロシュ分子診断
プラスミドマキシキット	キアゲン	12162
UV光源