細菌ワクチン抗原の構造的完全性を評価するためのウェスタンブロット

要約

出典: ギルモア、SF 他。 ワクチン開発のための Chlamydia muridarum 由来の組換え主要外膜蛋白質への無細胞スケール生産とアジュバント添加 J. Vis. 経験。 (2022年)

このビデオでは、ウェスタンブロッティングを使用して、ナノ粒子ベースのワクチン複合体内の主要な外膜タンパク質(MOMP)の構造的完全性を評価する方法を示します。タンパク質導入、抗体標識、蛍光イメージングに関わる主要なステップについて概説します。

プロトコル

1. ウェスタンブロット

1. ウェスタンブロッティングの場合、主要な外膜タンパク質(MOMP)-テロデンドリマーナノリポタンパク質粒子(tNLP)をSDS-PAGEで分離し、メーカーのプロトコルに従って標準設定の市販のドライブロッティングシステムを使用してゲルを転写します。
   1. 転写が完了したらスタックからブロットを取り除き、0.2%トゥイーン20と、Δ49ApoA1タンパク質のHisタグに対して0.5 mg/mLモノクローナル抗体(MAb)40または0.2 mg/mLのMAbHIS抗Hisタグ抗体を含む適切なブロッキングバッファーで、各ブロットを4°Cで一晩インキュベートします。
      手記： ブロッティングに使用される抗体希釈液は、MAb40で1:1,000、MAbHIS抗体で1:500〜1,000です。
   2. 各ブロットをPBS-T(1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.2%トゥイーン20、pH 7.4)で5分間3回洗浄します。
   3. 蛍光色素(赤外線色素(IRDye)など)に結合した二次抗体を含むブロッキングバッファー中でブロットを1:10,000希釈で1時間インキュベートします。
   4. ブロットをPBS-Tで5分間3回再洗浄します。蛍光イメージャーを使用して、最終洗浄後にブロットを画像化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
iBlot+2:22 ドライブロッティングシステム	ライフテクノロジー
iBlot 2転写スタック、PVDF	ライフテクノロジー	IB24001
Image Studio V2.0ソフトウェア	Li-COR バイオサイエンス
イミュンブロットPVDFメンブレン	バイオラッド	1620177
LI-COR Odyssey Fcイメージャー	Li-COR バイオサイエンス
0.2%トゥイーンを含むTBS中のオデッセイブロッキングバッファー20	Li-CORバイオサイエンス	927-50000
オービタルシェーカー
PBS-T(1x PBS、0.2% トゥイーン 20、pH 7.4)
一次抗体:MAb40( C. muridarum MOMPの可変ドメイン1(VD1)に対するモノクローナル抗体
一次抗体:MAbHIS、Penta-His抗体	キアゲン	34660
二次抗体:IRDye 800CWヤギ(ポリクローナル)抗マウスIgG(重および軽)	Li-CORバイオサイエンス	926-32210