高電圧エレクトロポレーションを用いた細菌の調製と形質転換

Abstract

出典: Stefan、A.、 et al.、 大腸菌におけるタンパク質共発現の多面的な利点。 J. Vis. 経験。 (2015年)

このビデオでは、抗生物質耐性遺伝子を保有するプラスミドで 大腸 菌を形質転換する手順(細胞調製、エレクトロポレーション、回収、形質転換体の選択など)を示します。

Protocol

1. 大腸菌 の共形質転換体の単離

1. 形質転換する適切な 大腸菌 株の電気コンピテント細胞を調製します。選択した菌株の単一コロニーを1 mlのLuria-Bertani(LB)培地(それぞれ10、5、および10 g / Lのトリプトン、酵母エキス、NaCl)に移し、180 rpmの振とう条件下で37°Cでインキュベートします。前培養を25 mlの新鮮なLB培地で1:500に希釈し、培養物を37°Cでインキュベートします。
2. 対数相(0.6 ODまたは光学密度)で、細胞懸濁液を5,000 x g で20分間遠心分離し、ペレットを元の培養量の半分の10%、v/v氷冷滅菌グリセロール水に再懸濁します。この手順を4回繰り返し、再懸濁量を半分にします。最後に、ペレットをグリセロール/水に再懸濁し、細胞懸濁液を50μlのアリコートに分割します。アリコートを-80°Cで最大6か月間保存します。
3. 目的のプラスミドを0.5 mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を添加した滅菌水に溶解します。電気コンピテント細胞のアリコートを氷上で解凍し、適量(2.5〜5 ng)のベクターと混合します。エレクトロポレーションに適した0.1 cmのキュベットに混合物を分注し、1.8 kVを塗布します。
4. エレクトロポレーションした細胞を1mlのSOC(異化物抑制を伴う超最適ブロス)培地(0.2%w / vグルコース、10 mM MgCl₂、2.5 mM KClを添加したLB培地)に直ちに移し、振とう下で1時間インキュベートし、最後に100 μlのアリコートを適切な抗生物質を含むLB寒天を含むペトリ皿に移します。O/Nを37°Cでインキュベートします。
5. ペトリ皿に単一のコロニーをストリーキングして、トランスフォーマーを精製します。

Materials