ベータグルコシダーゼアッセイを使用した細菌の突然変異頻度の評価

要約

出典: Stefan、A.、 et al。 大腸菌における蛋白質共発現の多面的利点 J. Vis. 経験。(96)、(2015)。

このビデオは、β-グルコシダーゼアッセイを使用した細菌の突然変異頻度の評価を示しています。校正欠損DNAポリメラーゼを発現する細菌培養物は、連続する世代にわたって収集されます。校正の減少によって引き起こされる複製エラーは、抑制されたベータグルコシダーゼ遺伝子を活性化する可能性があります。遠心分離および透過処理の後、基質を添加し、酵素活性を測定して、サンプル全体の突然変異頻度を定量化します。

プロトコル

1. 大腸菌または大腸菌の単離 共形質転換体

1. 形質転換する適切な 大腸菌 株の電気コンピテント細胞を調製します。選択した菌株の単一コロニーを1mlのルリア-ベルタニ(LB)培地(それぞれ10、5、および10 g / Lでトリプトン、酵母抽出物、塩化ナトリウムまたはNaCl)に移し、180 rpmの振とう条件下で37°Cでインキュベートします。前培養を25 mlの新鮮なLB培地で1:500に希釈し、培養物を37°Cでインキュベートします。
2. 対数相(0.6 OD)で、細胞懸濁液を5,000 x g で20分間遠心分離し、ペレットを元の培養量の半分の10%、v/vの氷冷滅菌グリセロール水に再懸濁します。このステップを4回繰り返し、毎回再懸濁量を半分にします。最後に、ペレットをグリセロール/水に再懸濁し、細胞懸濁液を50μlのアリコートに分割します。アリコートを-80°Cで最大6か月間保存します。
3. 0.5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加した滅菌水に所望のプラスミドを溶解します。電気コンピテント細胞のアリコートを氷上で解凍し、適量(2.5〜5 ng)のベクターと混合します。エレクトロポレーションに適した0.1cmのキュベットに混合物を分注し、1.8kVを塗布します。
4. エレクトロポレーションした細胞を異化物抑制(SOC)培地(0.2%w / vグルコース、10 mM塩化マグネシウムまたはMgCl₂、2.5 mM塩化カリウムまたはKClを添加したLB培地)を含む1 mlの超最適なブロスに直ちに移し、振とう下で1時間インキュベートし、最後に100 μlのアリコートを適切な抗生物質を含むLB寒天培地を含むペトリ皿に移します。37°Cで一晩(O / N)インキュベートします。
5. ペトリ皿に単一のコロニーをストリーキングして、トランスフォーマーを精製します。
6. 初代形質転換体の電気コンピテント細胞を調製し、ステップ1.1〜1.5を繰り返して、さらにプラスミドで形質転換します。
7. 共形質転換体のグリセロールストックを調製します。適切な抗生物質を添加したLBに単一のコロニーを移し、振とうしながら37°Cでインキュベートし、対数相(0.6 OD)で細胞懸濁液を5,000 x g で20分間遠心分離します。ペレットを15%v / vグリセロールを含むLB抗生物質培地に再懸濁します。アリコートで分注し、-80°Cで保管します。

2. 大腸菌DNAポリメラーゼIIIの野生型εサブユニットと変異原性εD12A変異体を共発現する集団の変異解析

1. pBAD-εおよびpGOOD1-εD12Aベクターを含む 大腸菌 TOP10の単一コロニーを1mlのLB抗生物質培地に移します。O/Nを37°Cでインキュベートします。
2. 新鮮な培地(10 ml)を含む3つのフラスコで前培養を1:250に希釈し、適切な誘導剤(アラビノース、イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)、またはアラビノースとIPTG、それぞれ1 mM)を加え、37°Cで8時間インキュベートします。非誘導培養物を並行して調製します。
3. 1mlのアリコートを集め、適切な誘導剤を添加したかどうかにかかわらず、新鮮な培地(10 ml)を含む新しいフラスコで1:500に希釈します。O/Nを37°Cでインキュベートします。
4. 手順2.2と2.3を繰り返し、1mlのアリコートを収集します。
5. 各カルチャで発生した世代数を決定します。LBプレートに移し、接種物と培養物の適切な連続希釈液100 μlを移します。O/Nを37°Cでインキュベートします。LBプレート上のコロニーをカウントし、接種物(log_I)および増殖終了時の培養物(log_C)に存在する細胞数の対数を計算します。世代数を決定するには、式を使用します: (log_C– log_I)/0.301。
6. 5,000 x g で 20 分間遠心分離し、細胞を 1 ml の 50 mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩 (Tris-HCl)、pH 7.6、50 mM NaCl に再懸濁します。細胞を透過処理するには、クロロホルムを2〜3滴加え、20秒間ボルテックスします。
7. p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド(PNPGluc)を基質として使用して、96ウェルマイクロコート中の各アリコートのβ-グルコシダーゼ活性を測定します。各ウェルに100 μlの透過処理細胞と100 μlの基質(16 mg / mlの水またはH₂Oのストック溶液)を加えます。井戸内の気泡を避けるように注意してください。マイクロプレートリーダーと適切なフィルターを使用して、420 nmで吸光度を読み取ります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
寒天	シグマ・アルドリッチ	A1296
アンピシリン	シグマ・アルドリッチ	A9518
クロロホルム	シグマ・アルドリッチ	288306
EDTAの	シグマ・アルドリッチ	EDSの
グリセロール	シグマ・アルドリッチ	G5516
IPTGの	シグマ・アルドリッチ	I5502
KCl	シグマ・アルドリッチ	P9541
L-アラビノース	シグマ・アルドリッチ	A3256
MgCl₂	シグマ・アルドリッチ	M2670
NaCl	シグマ・アルドリッチ	31434
PMSF	シグマ・アルドリッチ	P7626
PNP-gluc	シグマ・アルドリッチ	N7006
テトラサイクリン	シグマ・アルドリッチ	87128
トリズマベース	シグマ・アルドリッチ	T1503
トリプトン	シグマ・アルドリッチ	95039
酵母エキス	フルーカ	70161
キュベット 0.1 cm	バイオラッド	1652089	エレクトロポレーション用
遠心分離機 5415R	エッペンドルフ
遠心分離機 Allegra 21R	ベックマン
クロマトグラフィー装置 GradiFrac	ファーマシアバイオテック
Gene Pulser II エレクトロポレーション	バイオラッド
マイクロプレートリーダー 550	バイオラッド
MiniProtean 3セル	バイオラッド
電源	バイオラッド