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1. 大腸菌または大腸菌の単離 共形質転換体
- 形質転換する適切な 大腸菌 株の電気コンピテント細胞を調製します。選択した菌株の単一コロニーを1mlのルリア-ベルタニ(LB)培地(それぞれ10、5、および10 g / Lでトリプトン、酵母抽出物、塩化ナトリウムまたはNaCl)に移し、180 rpmの振とう条件下で37°Cでインキュベートします。前培養を25 mlの新鮮なLB培地で1:500に希釈し、培養物を37°Cでインキュベートします。
- 対数相(0.6 OD)で、細胞懸濁液を5,000 x g で20分間遠心分離し、ペレットを元の培養量の半分の10%、v/vの氷冷滅菌グリセロール水に再懸濁します。このステップを4回繰り返し、毎回再懸濁量を半分にします。最後に、ペレットをグリセロール/水に再懸濁し、細胞懸濁液を50μlのアリコートに分割します。アリコートを-80°Cで最大6か月間保存します。
- 0.5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加した滅菌水に所望のプラスミドを溶解します。電気コンピテント細胞のアリコートを氷上で解凍し、適量(2.5〜5 ng)のベクターと混合します。エレクトロポレーションに適した0.1cmのキュベットに混合物を分注し、1.8kVを塗布します。
- エレクトロポレーションした細胞を異化物抑制(SOC)培地(0.2%w / vグルコース、10 mM塩化マグネシウムまたはMgCl2、2.5 mM塩化カリウムまたはKClを添加したLB培地)を含む1 mlの超最適なブロスに直ちに移し、振とう下で1時間インキュベートし、最後に100 μlのアリコートを適切な抗生物質を含むLB寒天培地を含むペトリ皿に移します。37°Cで一晩(O / N)インキュベートします。
- ペトリ皿に単一のコロニーをストリーキングして、トランスフォーマーを精製します。
- 初代形質転換体の電気コンピテント細胞を調製し、ステップ1.1〜1.5を繰り返して、さらにプラスミドで形質転換します。
- 共形質転換体のグリセロールストックを調製します。適切な抗生物質を添加したLBに単一のコロニーを移し、振とうしながら37°Cでインキュベートし、対数相(0.6 OD)で細胞懸濁液を5,000 x g で20分間遠心分離します。ペレットを15%v / vグリセロールを含むLB抗生物質培地に再懸濁します。アリコートで分注し、-80°Cで保管します。
2. 大腸菌DNAポリメラーゼIIIの野生型εサブユニットと変異原性εD12A変異体を共発現する集団の変異解析
- pBAD-εおよびpGOOD1-εD12Aベクターを含む 大腸菌 TOP10の単一コロニーを1mlのLB抗生物質培地に移します。O/Nを37°Cでインキュベートします。
- 新鮮な培地(10 ml)を含む3つのフラスコで前培養を1:250に希釈し、適切な誘導剤(アラビノース、イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)、またはアラビノースとIPTG、それぞれ1 mM)を加え、37°Cで8時間インキュベートします。非誘導培養物を並行して調製します。
- 1mlのアリコートを集め、適切な誘導剤を添加したかどうかにかかわらず、新鮮な培地(10 ml)を含む新しいフラスコで1:500に希釈します。O/Nを37°Cでインキュベートします。
- 手順2.2と2.3を繰り返し、1mlのアリコートを収集します。
- 各カルチャで発生した世代数を決定します。LBプレートに移し、接種物と培養物の適切な連続希釈液100 μlを移します。O/Nを37°Cでインキュベートします。LBプレート上のコロニーをカウントし、接種物(logI)および増殖終了時の培養物(logC)に存在する細胞数の対数を計算します。世代数を決定するには、式を使用します: (logC– logI)/0.301。
- 5,000 x g で 20 分間遠心分離し、細胞を 1 ml の 50 mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩 (Tris-HCl)、pH 7.6、50 mM NaCl に再懸濁します。細胞を透過処理するには、クロロホルムを2〜3滴加え、20秒間ボルテックスします。
- p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド(PNPGluc)を基質として使用して、96ウェルマイクロコート中の各アリコートのβ-グルコシダーゼ活性を測定します。各ウェルに100 μlの透過処理細胞と100 μlの基質(16 mg / mlの水またはH2Oのストック溶液)を加えます。井戸内の気泡を避けるように注意してください。マイクロプレートリーダーと適切なフィルターを使用して、420 nmで吸光度を読み取ります。