光合成細菌からのプラストグロブレスの抽出と精製

要約

出典: Shivaiah、K.、 et al。植物葉組織とシアノバクテリアからのプラストグロブ脂滴の単離 J. Vis. 経験。 (2022年)

このビデオは、シアノバクテリアからのプラストグロビュルの単離を示しています。それはシアノバクテリアの培養から始まり、機械的な力を使用して細胞破壊を経て進行します。光合成色素の放出は、溶解の成功を示します。次に、スクロースステップ勾配を使用して細胞成分を密度によって分離し、低密度プラストグロビュアが上部に明確なバンドを形成できるようにします。この画分は収集され、さらなる分析のために保存されます。

プロトコル

1.粗プラストグロブールの単離

1. シアノバクテリアからの粗プラストグロブール抽出
   1. Synechocystis sp. PCC 6803の50 mL培養物を固定相(約7〜10日)まで増殖させ、分光光度計を使用して細胞密度を750 nm(OD₇₅₀)での光学密度2.0に調整します。培養条件では、BG-11培地を使用し、インキュベーターで150μmol光子/m²/s、2%CO₂、32°Cの光強度で増殖させ、毎分150回転(rpm)で連続振とうします。
   2. 多糖類を除去するには、50 mL培養物を6,000 × gで4°Cで45分間遠心分離し、続いて上清を除去して細胞を洗浄します。50 mLのバッファーAで細胞を2回洗浄して続行します(表1)。細胞ホモジネートのアリコートを取り出し、遠心分離前に取っておき、代表的な全細胞サンプルとして保存します
   3. 洗浄したペレットを25 mLのバッファーAに再浮遊し、フレンチプレッシャーセルを使用して1,100ポンド/平方インチ(psi)で細胞を破壊し、白色光下で溶解した色が緑から赤-青-緑に変わるまで、プロセスを3×繰り返します(タンパク質の変性を避けるために各サイクルの間にサンプルを氷上に置きます)。予冷セルを使用し、冷蔵室でこの手順を実行します。
   4. 得られたホモジネートを、各チューブに最大2.5 mLまで充填された8本の3 mL超遠心チューブに分配し、400 μLの培地Rで慎重にオーバーレイして、ステップ勾配を生成します。
   5. 必要に応じて培地Rを追加してチューブのバランスを慎重に調整し、4°Cで150,000 × gで30分間遠心分離します。チラコイドおよびその他のより重い細胞小器官(ポリヒドロキシアルカノエート体を含む)はペレット化しますが、プラストグロビュルはスクロース勾配の上部または近くに黄色の油性パッドとして容易に見えます(図1C)。
   6. 得られた粗プラストグロビュルのフローティングパッドをシリンジと22G針で採取し、2mLチューブに沈着させます。必要に応じて、針先で超遠心分離管壁の側面からプラストグロビュルをこすり落とします。
   7. 手順 2.2 に進みます。または、粗プラストグロビュルを-80°Cで保存し、後で精製します。

表1:植物の葉組織またはシアノバクテリアからプラストグロブールを単離するためのバッファーレシピ。

バッファー構成
粉砕バッファー	50 mM HEPES-KOH (pH 8.0)
	5 mM塩化マグネシウム(MgCl2)
	100 mMソルビトール
	5 mMアスコルビン酸 b
	5 mM還元システイン b
	0.05 % (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) b
ミディアムR	50 mM HEPES-KOH (pH 8.0)
	5 mM MgCl2
ミディアム R 0.2	50 mM HEPES-KOH (pH 8.0)
	5 mM MgCl2
	0.2 Mショ糖
ミディアム R 0.7	50 mM HEPES-KOH (pH 8.0)
	5 mM MgCl2
	0.7 Mショ糖
バッファーA	25 mM HEPES-KOH (pH 7.8)
	250 mMスクロース
ある。各緩衝液成分の最終濃度が示されています。
b.隔離当日に新鮮に追加する必要があります。緩衝液は単離の前日に調製できますが、特定の成分は、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤と同様に、単離の日に新鮮なものを追加する必要があります。

2.純粋なプラストグロビュルの採取

1. シアノバクテリア加工
   1. 4本の2.5 mL超遠心チューブでスクロース勾配を生成し、最初にステップ1.3の粗プラストグロビュル500 μLを750 μLの培地R 0.7と混合して層状にし、次に750 μLの培地R 0.2でオーバーレイします。
   2. スクロース勾配を150,000 × gで4°Cで90分間遠心分離します。純粋なプラストグロビュル(図1C)をシリンジと22 G針でスクロース勾配の最上相から収集し、1.5 mLチューブに移します。
   3. 純粋なプラストグロビュルを分注し、液体窒素中で急速凍結します。-80°Cで直接保存するか、乾燥粉末に凍結乾燥します。

結果

図1:プラストグロビュルとチラコイドの単離と免疫ブロッティング。 (A)スクロース勾配から抽出する前の Z.メイズ からの代表的な精製プラストグロブールサンプル。(B)スクロースクッションから抽出する前の乾燥した E.ニンデンシス からの代表的な粗プラストグロブールサンプル。(C) Synechocystis sp. PCC 6803か...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アスコルビン酸	BDHの	BDH9242
ウシ血清アルブミン	プロリアントバイオロジカル	68700
フレンチプレッシャーセル(モデルFA-079)	SLM/アミンコ	該当なし
ヘペス	シグマ・アルドリッチ	H3375
塩化マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	M8266
マルチトロン振とうインキュベーター	インフォーサー HT	該当なし
水酸化カリウム	フィッシャーケミカルズ	M16050
システインの減少	MP生化学	101444
ソルビトール	シグマ・アルドリッチ	S3889
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	S9378
シネコシスチス属PCC 6803	該当なし	該当なし
Optima MAX-TL超遠心分離機	ベックマン・コールター	A95761