無菌 C.elegansにおける腸内細菌のコロニー形成の評価

要約

出典:テイラー、MN、et.al。Caenorhabditis elegansと細菌の相互作用における不均一性を定量化するための単一ワームデータを用いたJ. Vis. 経験。(2022年)

このビデオは、無菌で年齢が一致した Caenorhabditis elegans ワームが腸内にコロニー形成するための細菌株にさらされる様子を示しています。これは、非付着細菌と外部細菌を選択的に除去し、定量化のために腸上皮に付着した生存細菌のみを残すことを説明しています。

プロトコル

1.液体培養で生きた細菌にワームを与える

手記： このプロトコルは、液体培養のよく混合された条件で実験室で培養された細菌でワームにコロニーを形成するために使用されます。ワームは、純粋な培養物からの個々の分離株(例: Enterococcus faeciumなどの病原体)または分離株の混合物(例:最小限のマイクロバイオームコミュニティ)でコロニー形成することができます。

1. 15 mLのコニカルチューブでスクロース洗浄された同期成虫から始めます。ワームを12 mLのSバッファーで1回洗浄し、上清を廃棄します。
2. 洗浄したワームを実験に必要なS培地の容量に再懸濁します。実験条件の量、ワームが分割される条件の数、およびワームとバクテリアの最終濃度を考慮してください。
   手記：ワームの摂食は細菌の利用可能性によって異なり、ワームは密集によってストレスを受ける可能性があります。液体培養におけるコロニー形成には、<1000ワーム/mLおよび>10⁷ CFU/mLが推奨されます。10¹¹ CFU/mL は、大腸菌に対する「自由」摂食密度と見なされます。
3. 細菌培養をスピンダウンします。上清を注ぎます。吸引またはピペッティングを使用して、緩いペレットを形成する細菌の上清を除去できます。
   手記： 培養物>5 mLの場合、15 mLチューブに移し、大型卓上遠心分離機で~2800 x g で8〜10分間回転させます。培養物<5 mLを1.5 mLチューブに移し、小型卓上遠心分離機で9000 x g で1〜2分間遠心分離できます。運動性の高い細菌(例えば、 シュードモナスの多くの種)は、安定したペレットの形成を促進するために4°Cで10〜15分間冷却する必要がある場合があり、4°Cで遠心分離する方が良い場合があります。
4. 細菌培養物を1容量のSバッファーに再懸濁し、再度遠心分離してペレット化します。前と同じように上清を取り除き、廃棄します。
5. 細菌培養物を実験に必要な密度でS培地に再懸濁し、選択用の抗生物質を加えます。使用する抗生物質がある場合は、コロニー形成に使用される細菌の耐性プロファイルによって異なります。
6. 0.01%Triton X-100(M9TX-01)を添加したM9ワームバッファーでコーティングされたピペットチップを使用して、ワームがS培地に完全に再懸濁されるまで、ワームをゆっくりと上下にピペットし、細菌のコロニー形成のためにチューブまたはプレートウェルに移します。
7. 各ワーム培養物に細菌懸濁液を加えて、所望の細菌濃度と最終量に到達します。
8. コロニー形成にマルチウェルプレートを使用する場合は、プレートを滅菌の96ウェルガス透過性シーリングメンブレンで覆います。
9. インキュベーション中に細菌が沈降するのを防ぐために、200 RPMで振とうしながらインキュベートします。

2. 96ウェルフォーマットでの個々のワームの機械的破壊

手記： このセクションでは、個々の細菌にコロニー形成されたC .エレガンスの機械的破壊のための96ウェルプレートフォーマットプロトコルについて説明します。プロトコルの最初のステップでは、付着していない細菌をワームの腸からパージし、寒冷麻痺と表面漂白を使用してワームの外部を洗浄する方法について説明します。これらのステップにより、細菌内容物の定量化のために機械的に破壊したり、さらなる実験に使用したりできる、清潔で生きた成虫が生成されます。このプロトコルは、液体培養、寒天プレート、または自然または小宇宙の土壌にコロニーを形成したワームの細菌を定量化するために適応することができます。

1. M9TX-01のアリコートを氷の上に置いて冷却します(mL単位のサンプル数の4〜5倍)。
2. M9TX-01 + 漂白剤(6%次亜塩素酸ナトリウム、1:1000または1:2000 v / v、サンプルあたり1 mL + 1 mL追加)のアリコートを調製し、氷の上に置いて冷やします。
3. 各ワームサンプルを1.5 mL微量遠心チューブ内の1 mLのM9TX-01に再懸濁します。
4. チューブを25°Cの低速ミニ遠心分離機(2,000 x g)で短時間(2〜3秒)回転させて、成体をペレット化します。上清をピペットで取り除き、ワームペレットを乱さないように注意して廃棄します。
5. 遠心分離を使用して、ワームを1 mLのM9TX-01で2回すすぎ、次に1 mLのM9ワームバッファーで1回すすぎ、外部細菌を減らします。
6. 寄着していない細菌をワーム腸からパージします。
   1. ワームの各サンプルを培養チューブ内の1 mLのS培地+2x加熱キルOP50に再懸濁します。
   2. 25°Cで20〜30分間インキュベートして、付着していない細菌を腸から通過させます。
      手記： これにより、細胞外蛍光タンパク質が内腔からパージされ、特に抗酸蛍光色素 (mCherry、dsRed など) が使用されている場合に、腸上皮に付着した標識細菌をより鮮明に視覚化できます。
7. 外部細菌を除去するための表面漂白ワーム。
   1. パージしたワームを1 mLの冷たいM9TX-01で2回すすぎ、上清を廃棄します。
   2. チューブを氷上(推奨)または4°Cで10分間冷やします。これにより、ワームが麻痺し、漂白剤の摂取が防止されます。
      手記： 他のプロトコルでは、レバミゾールなどの化学麻痺剤が使用されます。これは、有害廃棄物の流れを追加する必要がある確立されたアプローチです。
   3. 1 mLの氷冷M9ワームバッファー+無香料漂白剤(8.25%水酸化ナトリウム、1:1000または1:2000 v / v)を各チューブに加えます。チューブを氷上(推奨)または4°Cで少なくとも10分間放置して、外部の細菌を殺します。
      手記： 漂白剤の濃度は1:1000を超えないようにしてください。麻痺したワームでも、死亡する可能性があります。
   4. 漂白剤バッファーをピペットで取り除き、廃棄します。漂白剤が除去されるまでワームがポンプを再開しないように、チューブを氷に戻します。
   5. 各チューブに1mLの冷たいM9TX-01を加えます。ミニ遠心分離機(25°Cで2,000 x g )で~5秒間回転させます。チューブを氷に戻します。上清を取り除き、廃棄します。
   6. このすすぎステップをさらに1 mLの冷たいM9TX-01で繰り返し、できるだけ多くの上清を捨てます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
漂白剤、業務用、次亜塩素酸ナトリウム8.25%	クロロックス
塩化カルシウム二水和物	フィッシャーサイエンティフィック	AC423525000
コレステロール	VWRの	AAA11470-30
クエン酸一水和物	フィッシャーサイエンティフィック	AC124910010
硫酸銅(II)五水和物	フィッシャーサイエンティフィック	AC197722500
Corning 6765 LSE ミニマイクロ遠心分離機	コーニング	COR-6765
Eppendorf 1.5 mL微量遠心チューブ、天然	エッペンドルフ
エッペンドルフ 5424R マイクロ遠心分離機	エッペンドルフ	5406000640	24箇所の冷蔵卓上マイクロ遠心分離機
エッペンドルフ 5810R ローター付き遠心分離機 S-4-104	エッペンドルフ	22627040	15-50 mLチューブおよびプレート用のアダプター付き3L卓上型遠心分離機
エッペンドルフプレートバケット(x2)、ローターS-4-104用	エッペンドルフ	22638930
エタノール100%	フィッシャーサイエンティフィック	BP2818500
硫酸鉄(II)七水和物	フィッシャーサイエンティフィック	423731000
硫酸マグネシウム七水和物	フィッシャーサイエンティフィック	AC124900010
塩化マンガン(II)四水和物	VWRの	470301-706
ペプトン	フィッシャーサイエンティフィック	BP1420-500
リン緩衝生理食塩水(1X PBS)	ゴールドバイオ	P-271-200
ポリプロピレン製オートクレーブトレイ、浅い	フィッシャーサイエンティフィック	13-361-10
水酸化カリウム	フィッシャーサイエンティフィック	AC134062500
リン酸二塩基性カリウム	フィッシャーサイエンティフィック	BP363-1
リン酸カリウム一塩基性	フィッシャーサイエンティフィック	BP362-1
スクープ型実験用へら、金属製	VWRの	470149-438
水酸化ナトリウム	VWRの	BDH7247-1
無水リン酸二塩基性ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	BP332-500
塩化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	BP358-1
クエン酸三カリウム一水和物	フィッシャーサイエンティフィック	AC611755000
トリトンX-100	フィッシャーサイエンティフィック	BP151-100
硫酸亜鉛七水和物	フィッシャーサイエンティフィック	AC205982500