宿主と細菌の相互作用の変動性を評価するための個々のワームの機械的破壊

要約

出典:テイラー、MN他。Caenorhabditis elegansと細菌の相互作用における不均一性を定量化するための単一ワームデータを用いたJ. Vis. 経験。(2022年)

このビデオは、機械的破壊による個々の Caenorhabditis elegans の腸内細菌負荷変動の定量化を示しています。個々のワーム間の腸内細菌負荷の違いを評価するためのサンプル調製、機械的破壊、連続希釈、およびコロニー計数の手順の概要を説明します。

プロトコル

1. ワームを炭化ケイ素グリットで深い96ウェルプレートに分離し、機械的破壊を行います。96ウェルディスラプションプレートを次のように準備します。
   1. 滅菌済みの2 mLディープウェル96ウェルプレートと、対応するシリコン96ウェルプレートカバーを入手します。
      手記： 組織破壊装置用の96ウェルアダプターと互換性のあるプレートを使用することが重要です。外形寸法のわずかな違いによって、アダプターから取り外せるプレートと取り外せないプレートの違いが生まれます。
   2. 滅菌スクープスパチュラを使用して、ワームを受け取るプレートの各ウェルに少量の滅菌36グリット炭化ケイ素を追加します。井戸の底をかろうじて覆うのに十分なグリットを使用します(井戸あたり約0.2 g)。材料が多すぎると、内容物を取り出すときにピペットチップをウェルの底に届けることが困難になります。
   3. 各ウェルに180 μLのM9ワームバッファーを加えます。
   4. 列または行にラベルを付けて、各サンプルがどこに行くかを示し、シリコン96ウェルプレートカバーでプレートをゆるく覆います。
2. 個々のワームを96ウェルプレートに移して破壊します。
   1. 透過処理されたワームを、0.01%Triton X-100(M9TX-01)を添加した十分なM9ワームバッファーを含む小さな(35または60 mm)ペトリ皿に慎重に移動させ、皿を~1 cmの深さまで満たします。
      手記： 多数のワームが存在する場合、液体が混雑し、個々のワームをピペットでピペッティングすることが困難になるため、サンプル全体を移すことが不可能な場合があります。
   2. 解剖顕微鏡またはその他の低倍率装置を使用して、20 μLの容量で個々のワームをピペットで取り除き、これらのワームを96ウェルプレートの個々のウェルに移します。
      手記： 殺したばかりのワームだけを収穫するのが最善です。硬い直線的な形状のワームは、しばらく前から死んでいる可能性があるため、避けてください。湾曲した、またはS字型で、正常な肉眼的生理機能と無傷の腸を持つワームを服用するようにしてください。
   3. 各ボリュームを転送した後、選択したワームが実際にウェルに排出されたことを確認します。これを行うには、ペトリ皿の透明な領域から20 μLのM9TX-01をピペットで汲み上げ、全量を皿に戻します。これにより、通常、ウォームがピペットにくっついていると排出されます。ワームが固着している場合は、ウェルから20 μLを取り出し、転写を再試行します。
   4. すべてのワームが移されたら、96ウェルプレートを市販の柔軟な紙裏面シールフィルム(2 x 2正方形)のシートで覆い、シールフィルムの紙裏面がサンプルウェルを下に向けていることを確認します。シールフィルムを薄く伸ばしすぎると、後で剥がすのが非常に困難になるのでご注意ください。
   5. シリコンシーリングマットを柔軟なシーリングフィルムの上に軽く置きます。このとき、カバーをウェルに押し込まないでください。
   6. プレートを4°Cに移動して30〜60分間冷やします。これにより、サンプルを損傷する可能性のある破壊中の過熱を防ぐことができます。
      手記： これはプロトコルのブレークポイントです。ほとんどの場合、プレートは粉砕前に4°Cで最大4時間放置できます。細菌数が変化するため、ワームを一晩放置しないでください。
3. 96ウェルプレートを組織破壊器にロードして、ワーム組織を分解し、腸内細菌を放出します。
   注: (オプション)消化に奇数の96ウェルプレートを使用する場合は、続行する前にカウンターウェイトを準備する必要があります。空の深い96ウェルプレートを使用し、最初のプレートと同じ重さになるまでウェルに水を入れます。
   1. シリコンシーリングマットをウェルにしっかりと押し込んでシールを作成し、蓋がプレートの表面全体に平らになるようにします。
      手記： 伸ばした後にフレキシブルシールフィルムが厚すぎると、シリコン蓋を固定してすべてのウェルに平らになるようにすることが困難になります。これにより、密閉性が不十分になり、振とう中に井戸間が汚染されます。
   2. 96ウェルプレートアダプターを使用して、プレートを組織破壊器に固定します。プレートを30Hzで1分間振とうした後、プレートを180°回転させ、もう一度1分間振とうします。これにより、プレートのすべてのウェルで均一な破壊が確実になります。
   3. プレートをベンチに2〜3回しっかりとたたき、柔軟なシールフィルムから砂を取り除きます。
   4. 2つの96ウェルプレートアダプターを備えた大型遠心分離機を使用して、プレートを2400 x g で2分間回転させ、すべての材料をウェルの底に集めます。
   5. シリコンの蓋を取り外し、柔軟なシールフィルムを慎重に引き抜きます。
      手記： フレキシブルシーリングフィルムがいずれかのウェルにくっついた場合は、200 μLのピペットチップを使用して除去します。これは、フレキシブルシールフィルムが薄くなりすぎる場合によく見られます。
4. ワーム消化サンプルを 300 μL で 96 ウェルプレートで連続希釈します。
   1. 200 μLに設定されたマルチウェルピペッターを使用して、ゆっくりと慎重に数回ピペットを上下させ、ウェルの内容物を再混合し、できるだけ多くの液体を引き出します。この液体を、破壊されたワームサンプルの連続希釈用に準備した96ウェルプレートの最上段に移します。
   2. 20 μLに設定された96ウェルピペッターを使用して、この量の液体を一番上の列から取り出し、列Bに分注します。上下に8〜10回ピペットで混ぜます。チップを破棄します。
   3. 手順4.2を繰り返し、行Bの0.1倍のサンプルから始めて、行Cに0.01倍の希釈サンプルを作成します。
   4. 手順4.2をもう一度繰り返して、行Cから行Dに移動します。
   5. 細菌定量のために固形寒天にプレートします。モノコロニー化ワームの場合、一般に寒天プレートに各希釈液[1x-0.001x]の10〜20 μL滴をプレートするだけで十分です。複数種のコロニー形成の場合は、10 cm寒天プレートに100 μLをピペッティングして、各希釈液を個別にプレートします。ガラスメッキビーズですぐに広げます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルプレートシーリングマット、シリコン、スクエアウェル(AxyMat)	アクシーゲン	AM-2ML-SQ
96ウェルプレート、2 mL、角型ウェル	アクシーゲン	P-2ML-SQ-C-S
96ウェルポリプロピレンプレート蓋	エバーグリーン実験器具	290-8020-03L
寒天	フィッシャーサイエンティフィック	443570050
ビーズミルアダプターセット 96ウェルプレート用	キアゲン	119900	TissueLyser IIの2つの96ウェルプレートで使用するためのアダプタープレート
ビーズミルティッシュホモジナイザー(TissueLyser II)	キアゲン	85300	ミディアムからハイスループットのサンプル破壊のための機械式ホモジナイザー
Breathe-Easy 96ウェルガス透過性シーリングメンブレン	多様なバイオテクノロジー	ベム-1	マルチウェルプレートガス透過性ポリウレタン膜薄いシールフィルムは、O₂、CO₂、水蒸気を透過し、300nmまでのUV透過性があります。滅菌、100/箱。
エッペンドルフ 5810R ローター付き遠心分離機 S-4-104	エッペンドルフ	22627040	15-50 mLチューブおよびプレート用のアダプター付き3L卓上型遠心分離機
エッペンドルフプレートバケット(x2)、ローターS-4-104用	エッペンドルフ	22638930
シャーレ, 円形, 10 cm	VWRの	25384-094