レジオネラニューモフィラにおける分泌系成分の極性とダイナミクスの定量化

要約

出典: Chetrit、D.、 et al。 Legionella pneumophila ドット/ICM分泌系の時空間的特徴を解消するための生細胞イメージングとクライオ電子断層撮影法の適用 J. Vis. 経験。 (2020年)

このビデオでは、生細胞蛍光イメージングを使用して、 レジオネラ・ニューモフィラの分泌系成分の極性とダイナミクスを定量化し、細菌の病因を理解するために重要な空間動員と細胞質ゾル再分布の分析を可能にする方法を示します

プロトコル

1. ドット/ICM成分の極性局在化とダイナミクスの定量化

手記： 次の手順は、2 x 2 ビニングで取得されたピクセルあたり 0.129 μm の画像用に設計されています。

1. sfGFP(スーパーフォルダーグリーン蛍光タンパク質)融合タンパク質の極性の定量化(図1)
   1. バクテリアがはっきりと見えるように画像のコントラストを調整します。領域ツールを使用して、極から始まり細胞質まで伸びる0.25 x 1.3 μm² の長方形を配置します。長方形は細菌の境界内に正確にとどまらなければなりません。
   2. 少なくとも 200 個の細菌をマークし、[ マスクする領域 ] ボタンを使用して、関心のある領域のマスクを作成します。 [マスク統計 ] と [マスク範囲] で、[ オブジェクト] を選択します。次に、 特徴 と 強度で、 平均強度 と 分散をマークします。
   3. データをエクスポートし、分散と平均強度の比率として各細菌の極性スコアを計算します。
   4. ハイスループットアプリケーションでは、位相対物レンズと適切なコンデンサーセットアップを使用して、位相チャネルと488 nmチャネルで画像を取得します。細菌が完全に分離されている視野を必ず選択してください。
   5. 画像の位相チャネルのコントラストを、細菌がはっきりと見えるレベルに調整します。デュアルチャンネル画像を開き、 セグメントマスクの作成 ウィンドウを起動して、チャンネルを位相に変更します。
   6. 適切なしきい値を調整し、[オブジェクトを定義]ボタンを使用して小さなオブジェクトを削除します。[マスクの調整]で、[エッジの削除][オブジェクト]を選択し、後で互いに隣接するバクテリアのマスクを分離します。
   7. 手順1.1.2〜1.1.3で説明したように、各セルの488チャネルの信号の極性スコアを計算します。
2. sfGFP融合タンパク質のダイナミクスの定量化(図2)
   手記： ダイナミクスは、時間の経過に伴う強度の変化として定義され、次の手順は短いイメージング期間 (つまり、数分) 用に設計されています。より長いイメージング期間が必要な場合は、適切なサプリメントをパッドに追加します。
   1. [画像キャプチャ]ウィンドウで、[タイムラプス]をマークし、[間隔]ボックスに間隔の時間を入力し、[#のタイムポイント]ボックスに2を入力します。目的の蛍光タンパク質を発現するレジオネラ・ニューモフィラの2つの連続した画像を取得します。
   2. セルがはっきりと見えるまで画像のコントラストを調整します。 図2A と以下の説明に従って、3つの異なるマスクを配置します。領域ツールを使用して、少なくとも400個のセルの中央に0.25 x 0.25 μmの正方形を配置します。
   3. [ マスクする領域 ]ボタンを使用して、目的の正方形のマスク(マスク1)を作成します。新しい空のマスク (マスク 2) を作成し、ピクセル ツールまたはポリゴン ツールを使用して、蛍光漂白の計算に使用される少なくとも 25 個のランダム セルのセル領域全体をマークします。新しい空のマスク(マスク3)を作成し、大きなブラシツールを使用してセル間の領域をマークし、背景の減算に使用されます。
   4. [ マスク統計情報 ] と [マスク スコープ] で、マスク 1 とマスク 2 の [オブジェクト ] を選択します。次に、[ 特徴 と 強度] で [ 平均強度 ] を選択し、2 つのマスクのデータをエクスポートします。マスク 3 の場合は、マスク全体の平均強度を書き出します。
   5. 次の式を使用して、マスク 1 内の各オブジェクトの蛍光強度の変化を計算します。

ここで、マスク1はセル中心に配置された0.25μm×0.25μmの正方形で、マスク2はセル全体を覆い、マスク3はセル間の背景、T1は最初の時点の平均強度、T2は2番目の時点の平均強度です。

結果

図1:Dot/Icm系サブユニットの極性局在化の定量化。 (A) Lp01 で発現するDotB-sfGFPのリアルタイム可視化は、極性局在を示しました。DotB-sfGFPは、 ドット/icm 遺伝子クラスター全体が欠失した株(∆T4SS)で発現すると、びまん性パターンを示しました。 dotB オペロンから発現した非融合sfGFPは、びまん性サイトゾルパターンを示し、コントロールとして機能...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100倍のPlan Apo対物レンズ(1.4 NA)	ニコン
CoolSNAP EZ 20MHzデジタルモノクロカメラ	測光
顕微鏡カバースライド 22x22 mm	フィッシャーサイエンティフィック	〒12-542B
顕微鏡カバースライド 24x50 mm	フィッシャーサイエンティフィック	12-545K
顕微鏡スライド 25x75x1 mm	グローブサイエンティフィック	1380
スライドブック 6.0	インテリジェントイメージングの革新
Spectra X ライトエンジン	ルメンコール