極低温電子断層撮影のための レジオネラニューモフィラ の調製

要約

出典: Chetrit、D.、 et al。 Legionella pneumophila ドット/ICM分泌系の時空間的特徴を解消するための生細胞イメージングとクライオ電子断層撮影法の適用 J. Vis. 経験。(2020年)

このビデオでは、細菌培養、金ナノ粒子マーキング、およびガラス化技術を組み合わせて、クライオ電子断層撮影用の レジオネラ・ニューモフィラ サンプルを調製する方法について説明します。このプロセスは、天然の細胞構造を保存し、膜関連分泌系コンポーネントの高解像度イメージングを可能にします。

プロトコル

1. Cryo-ETによるsfGFP質量密度の検出

1. サンプルの調製、データ収集、再構成

1. 蛍光タグ付きドット/Icmタンパク質を発現する レジオネラニューモフィ ラの重いパッチを、37°Cで48時間、CYE-寒天-ストレプトマイシンプレート上で増殖させます。細胞をddH₂OでOD₆₀₀ 0.7に再懸濁します。5 μLの金コロイド粒子(BSAトレーサー、10 nm)を20 μLの細胞懸濁液に加えます。

2.5 μLの細胞混合物を、新たに放電したての穴あくれたカーボングリッド(Cu 200メッシュのR 2/1)にピペットで移動し、1分間放置します。ろ紙で吸い取り、重力駆動プランジャー装置を使用して液体エタンで凍結します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10nmの金コロイド粒子	オーリオン	25486
100倍のPlan Apo対物レンズ(1.4 NA)	ニコン
エース	シグマ・アルドリッチ	A9758
CoolSNAP EZ 20MHzデジタルモノクロカメラ	測光
遺伝子フレーム、1.7x2.8 cm、125 μL	フィッシャーサイエンティフィック	AB-0578
Holey カーボン グリッド R 2/1 Cu 200 メッシュ	クアンティフォイル	Q225-CR1
硝酸鉄(III)非水和物	シグマ・アルドリッチ	216828
クライオEM用K2 Summitカメラ	ガタン
顕微鏡カバースライド 22x22 mm	フィッシャーサイエンティフィック	〒12-542B
顕微鏡カバースライド 24x50 mm	フィッシャーサイエンティフィック	12-545K
顕微鏡スライド 25x75x1 mm	グローブサイエンティフィック	1380
スライドブック 6.0	インテリジェントイメージングの革新
Spectra X ライトエンジン	ルメンコール