急速に成長する細菌ビブリオナトリゲンの培養

要約

出典:Wiegand, D. J., Lee, et al., Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens.J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、増殖の早い細菌である ビブリオ・ナトリゲンを、粗抽出物生成用の細菌ペレットを調製するための曝気条件下で培養および収穫する方法を示します。

プロトコル

ビブリオナトリゲン粗細胞抽出物の調製-細菌培養

1. 表1に従って、V.ナトリゲンス細菌増殖培地LB-V2(V2塩を含む溶原性ブロス)を調製します。オートクレーブ滅菌により増殖培地を滅菌します。培地を室温(RT)にします。余分な培地をRTに保管してください。
   注意： オートクレーブを操作するときは、適切な個人用保護具(PPE)を着用し、ラボ固有の指示を参照してください。
2. 野生型 V.ナトリゲン のグリセロールストックを使用して、3 mLのLB-V2培地を接種します。225rpmで振とうしながら、30°Cで一晩成長させます。
3. 一晩培養物1 mLを卓上遠心分離機で10,600 x g で遠心分離して1分間洗浄します。得られたペレットを乱すことなく上清を吸引し、1 mLの新鮮なLB-V2培地に再懸濁します。
4. 滅菌カバー付きのオートクレーブ滅菌済み4 Lバッフル三角フラスコに、1 Lの新鮮なLB-V2増殖培地を加えます。洗浄した一晩培養物1 mL(希釈比1:1,000)を使用して接種します。培養物を30°Cで増殖させ、225rpmで振とうします。
   注: V.ナトリゲンス 培養物は、1:1,000の希釈比を維持しながらスケールアップまたはスケールダウンできます。たとえば、250 μLの洗浄した一晩培養物を、滅菌カバー付きの2 Lバッフル三角フラスコの250 mLの新鮮なLB-V2増殖培地に加えます。
5. 分光光度計を使用して培養物のOD₆₀₀ を監視します。培養物がOD₆₀₀ = 1.0 ± 0.2に達したら、4°Cで20分間、3,500 x g で遠心分離して培養物を収穫します。ペレットを氷の上に置きます。
   注: V.ナトリゲンスは 急速に成長するため、培養の綿密な監視が必要です。OD₆₀₀ = 1.0への成長には、1:1,000の希釈比で約1.5〜2時間かかります。
6. 上清を吸引し、得られた細菌ペレットを直ちに-80°Cで保存するか、直接細胞溶解に進みます。
   手記： このステップは良い停止点です。ただし、最良の結果を得るには、ペレットをすぐに処理するか、1〜2日以内に処理することをお勧めします。

表1:1LのLB-V2細菌増殖培地を調製するための試薬

表1 A	LB-V2細菌増殖培地の調製
コンポーネント	数量(g)	最終濃度 (mM)	最終容量(L)
LBブロス(ミラー)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
KCl	0.31	4.2
表1 B	S30A溶解バッファーの調製
コンポーネント	数量(g)	最終濃度 (mM)	最終容量(L)
トリス溶液 (pH 8.0) - 1 M (mL)	25	50	0.5
Mg-グルタミン酸	2.72	14
K-グルタミン酸	6.10	60
ジチオスレイトール (DTT) - 1 M (mL)	1	2

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2 mLチューブ	エッペンドルフ	22363352
HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)	シグマ	H3375
LB(ルリア・ベルタニ)スープ(ミラー)	シグマ	L3522
塩化マグネシウム(MgCl₂)	シグマ	M8266
塩化カリウム(KCl)	シグマ	P9333
塩化ナトリウム(NaCl)	シグマ	S7653
トリス溶液(pH 8.0) - 1 m	インビトロゲン	AM9856
Vibrio natriegens (野生型) 凍結乾燥ストック	ATCCの	14048