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1. 無細胞反応成分の調製
一般的な反応成分 Mg-グルタミン酸とK-グルタミン酸の作業ストックを、それぞれ100 mMと2000 mMの濃度の滅菌DI(脱イオン)水で50 mLチューブに調製します。 250 mLビーカーに100 mLの滅菌DI水を加えて、50%(w / v)ポリエチレングリコール(PEG)-8000のワーキングストックを調製します。小さなマグネチックスターラーをビーカーに入れます。PEG-8000 50 g の重量を量り、ビーカー内の 100 mL の水に加えます。 ビーカーを100°Cに設定した加熱した撹拌プレートに置き、PEG-8000が溶液に入るまで250 rpmで撹拌します。PEG-8000液体混合物を冷ましてから、50 mLチューブに移します。 エネルギーソリューションマスターミックス 500 mLの滅菌DI水に140 gのKOHペレットを加えて、5 MのKOH溶液を調製します。注意： この溶液をケミカルフードで準備し、強力な塩基を取り扱うときはPPEを着用してください。溶液が熱くなるため、圧力の上昇を防ぐためにボトルのキャップを緩める必要があります。使用する前に、KOH溶液をRTに到達させます。 100 mLボトルに20.85 gのHEPESを加えて、1750 mM HEPES-KOHバッファーを調製します。容量が40 mLに達するまで滅菌DI水をゆっくりと加えます。HEPESを溶解するためのボルテックスボトル。5 M KOH溶液を使用してpHを8.0に調整し、溶液の容量を50 mLにします。注意： pHを調整するときは、適切なPPEを使用してKOHを処理する必要があります。 残りの10倍エネルギーマスターミックスストック成分を表 1 に示す濃度で滅菌脱イオン水中で調製し、各ストックを氷上に置きます。100 mM ATP、GTP、CTP、およびUTPストックをRTで解凍し、氷上に置きます。手記： 必要に応じて、37 °C および 350 rpm に設定されたサーモミキサーを使用して、試薬を溶液に溶解できます。サーモミキサーに試薬を長時間放置したり、過熱したりしないでください。 15 mLチューブに、 表1 に指定された順序と容量に従って、各エネルギー溶液マスターミックス成分を追加します。各成分が追加された後、溶液をボルテックスします。これにより、5 mL の 10x エネルギー溶液マスターミックスが作られます。 10x エネルギー溶液マスターミックスを 200 μL アリコートに分けて、2 mL チューブに入れます。各アリコートを急速凍結します。すぐに-80°Cの冷凍庫に入れて使用してください。 アミノ酸マスターミックス 新鮮な4xアミノ酸マスターミックスを調製するには、まず各アミノ酸ストックをRTで解凍し、次にそれぞれを氷上に置きます。ボルテックスおよび/またはサーモミキサーを37°Cおよび350rpmに設定して、すべてのアミノ酸ストックが完全に溶解していることを確認します。手記： システインは完全に溶解しない場合があります。懸濁液としてアミノ酸マスターミックスに添加できます。サーモミキサーに試薬を長時間放置したり、過熱したりしないでください。 15 mLチューブに、適切な量のアミノ酸を滅菌DI水に加え、それぞれの最終濃度が次の順序で8 mMになるようにします:ALA、ARG、ASN、ASP、GLN、GLU、GLY、HIS、IIE、LYS、MET、PHE、PRO、SER、THR、VAL、TRP、TYR、LEU、およびCYS。各アミノ酸を加えた後、マスターミックス溶液をボルテックスします。 表 1 にリストされている容量は、2.4 mL のアミノ酸マスターミックスを構成します。 4xアミノ酸マスターミックスを200 μLのアリコートに分けて、2 mLチューブに入れます。各アリコートを急速凍結します。すぐに-80°Cの冷凍庫に入れて使用してください。 反応可能なプラスミドDNAテンプレートの製造 手記： このシステムにおける無細胞タンパク質の発現は、スーパーフォルダーグリーン蛍光タンパク質(GFP)発現ベクターT7-pJL1-sfGFP(材料表 )を使用して最適化されています。このプラスミドは、無細胞反応効率のコントロールとして、pJL1バックボーンを他のタンパク質配列のクローニングと発現に使用することをお勧めします。他のプラスミドDNAテンプレートを使用できます。ただし、転写はT7プロモーター配列とT7 RNAポリメラーゼの存在によって制御されることに注意することが重要です。形質転換された 大腸菌 から任意のプラスミドDNAテンプレートを大規模に生産するための簡単なプロトコルを以下に説明します。製造元の指示に従って、プラスミド精製キットを使用して目的のベクターを精製します( 材料表 )。注:プラスミドDNAテンプレートを可能な限り濃縮することは、無細胞反応の厳しい体積制約を満たすために推奨されます。一般に、750-1500 ng/μLの作業原液を目指します。 2. V. natriegens 粗抽出物 を用いた無細胞タンパク質発現反応の実施
プラスミドまたは線状DNAテンプレートを用いた無細胞タンパク質発現 -80 °C 冷凍庫から 10 倍のエネルギー溶液マスターミックスと 4 倍のアミノ酸マスターミックスのアリコートを取り出し、RT で解凍し、氷の上に置きます。T7 RNAポリメラーゼとRNase阻害剤のストックを-20°Cの冷凍庫から取り出し、氷の上に置きます。DNAテンプレートをRTで解凍し、氷の上に置きます。 表2に従って、氷上の2 mLチューブに各成分を次の順序で添加することにより、 無 細胞反応マスターミックスを調製します:アミノ酸マスターミックス、エネルギー溶液マスターミックス、Mg-グルタミン酸、K-グルタミン酸、DNAテンプレート、PEG-8000、T7 RNAポリメラーゼ、およびRNase阻害剤。 マスターミックスに加えるたびにチューブをそっとフリックします。手記： 無細胞タンパク質発現に線形テンプレートを使用する場合は、プラスミドテンプレートと比較して5〜10倍の材料を追加して、かなりのタンパク質収量を得る。 V.ナトリゲンス 粗細胞溶解物を-80°Cの冷凍庫から取り出し、解凍するまで氷の上に10〜20分間置きます。表2 に従って、適切な量の粗細胞抽出物を無細胞反応マスターミックスに加え、上下にフリックまたはピペッティングして穏やかに混合します。サーモサイクラーを用いたエンドポイント無細胞タンパク質発現無細胞反応マスターミックス10 μLを96ウェルまたは384ウェルPCRプレートの底にピペットで移動します。PCRプレートへの各移送の間に、チューブを軽くフリックしてマスターミックスを混合します。手記： 無細胞反応マスターミックスは、すべてのサンプルで反応の再現性と無細胞タンパク質の発現を最大化するために、常に十分に混合する必要があります。 プレートを1,000 x g で10秒間短時間遠心分離して、ウェルの側面に詰まった可能性のあるマスターミックスをプールします。蒸発を防ぐためにプレート接着剤でウェルを密封し、PCRプレートを105°Cに設定した加熱蓋で26°Cに設定したサーモサイクラーに入れます。手記： サーモサイクラーの均一な熱分布と加熱された蓋により、タンパク質の発現収量が大幅に向上します。 無細胞反応を最低3時間インキュベートします。インキュベーション後、発現したタンパク質を精製、定量し、下流プロセスに使用できます。手記： 発現したタンパク質は、ユーザーが選択した方法を使用して無細胞反応で直接定量できます。たとえば、蛍光タンパク質は外部標準曲線を使用して定量したり、無細胞反応で放射性標識アミノ酸を使用した場合は放射能を測定したりできます。紫外可視分光法または全タンパク質アッセイは、初期精製を行わずに無細胞反応でタンパク質産生を直接測定する場合には、一般に推奨されません。 表1:5 mLの10xエネルギー溶液マスターミックスおよび2.4 mLの4xアミノ酸マスターミックスを調製するための試薬。
10x Energy Solution マスターミックス コンポーネント ストック濃度(mM) 最終濃度 (mM) 量(μL) 最終容量(μL) HEPES-KOH pH 8 1750 500 1428.57 5000 ATPの 100 15 750.00 GTPの 100 15 750.00 CTPの 100 9 450.00 UTPの 100 9 450.00 大腸菌 由来のtRNA MRE 600 (mg/mL)*100 2 100.00 コエンザイムAハイドレート 200 2.6 65.00 NADの 200 3.3 82.50 キャンプ 650 7.5 57.69 フォリン酸 100 0.7 35.00 スペルミジン 1600 10 31.25 3-PGAの 2000 300 750.00 滅菌脱イオン水 49.99 4xアミノ酸マスターミックスの調製 コンポーネント ストック濃度(mM) 最終濃度 (mM) 量(μL) 最終容量(μL) 翼 168 8 114.3 2400 ARG 168 8 114.3 ASNの 168 8 114.3 ASP 168 8 114.3 GLNの 168 8 114.3 GLUの 168 8 114.3 グライ 168 8 114.3 彼の 168 8 114.3 IIEの 168 8 114.3 リス 168 8 114.3 会った 168 8 114.3 PHEを 168 8 114.3 プロ 168 8 114.3 セル 168 8 114.3 THR 168 8 114.3 ヴァル 168 8 114.3 TRP 168 8 114.3 ティル 168 8 114.3 ルー 140 8 137.1 サイス 168 8 114.3 滅菌脱イオン水 91.4
の調製表2:DNAテンプレート用に最適化された V.ナトリゲンス 細胞反応マスターミックス の成分
無細胞反応マスターミックス コンポーネント ストック濃度(mM) 最終濃度 (mM) 量(μL)1x反応 量(μL)50倍反応 抽出(%) 25 2.50 125.00 Mg-グルタミン酸 100 3.5 0.35 17.50 K-グルタミン酸 2000 80 0.40 20.00 4x アミノ酸マスターミックス 8.0 2 2.50 125.00 10x エネルギーソリューションマスターミックス 1.00 50.00 プラスミドDNA(ng/μL) 1000 500 0.50 25.00 50% PEG-8000 (%) 50 2 0.40 20.00 T7 RNAポリメラーゼ 1.00 50.00 RNase阻害剤、マウス 0.10 5.00 滅菌脱イオン水 1.25 62.50 反応量(μL): 10