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方法論記事

マイクロ流体マイクロ液滴培養システムを使用した細菌増殖のリアルタイムモニタリング

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2025年10月30日

この記事について

要約

出典: Jian、X. ら、 微生物微小液滴培養システム(MMC)を使用した自動微生物培養と適応進化。 J. Vis. 経験。(2022年)

このビデオでは、細菌の増殖をリアルタイムで監視するためのマイクロ流体液滴ベースのプラットフォームの使用を示しています。細菌懸濁液を含む均一な液滴を生成し、検出経路に誘導することで、細胞密度を連続的に光学的に測定し、成長曲線を構築することができます。

プロトコル

1. 準備

  1. シリンジニードル(内径0.41mm、外径0.71mm)、クイックコネクタA、試薬ボトル(図1C)を接続し、121°Cで15分間オートクレーブします。
    手記： 滅菌中は試薬ボトルのキャップを少し緩めます。使用するたびにさらに数本の試薬ボトルを準備できます。
  2. 0.22 μmのポリフッ化ビニリデン(PVDF)フィルターを使用して、微小液滴培養システム(MMC)オイルをろ過します。マイクロ流体チップ(図1B)とMMCオイルを事前にクリーンベンチに入れ、紫外線照射で30分間滅菌してから使用してください。
    手記： クイックコネクタA、試薬ボトル、MMCオイル、マイクロ流体チップの詳細については、 材料表を参照してください。
  3. マイクロ流体チップの取り付け
    1. 手術室のドア(図1A)を開き、光ファイバープローブを持ち上げます。
    2. 電界穴を電界針に合わせ、チップをチップ台座にそっと置きます。次に、2つの位置決めコラムを位置決め穴に挿入し、光ファイバープローブを置きます(図1D)。
    3. チップのクイックコネクタAを、位置番号(C5-O5、C4-O4、C6-O6、C2-O2、CF-OF、C1-O1、C3-O3)に従ってMMCの対応するポートに接続します。次に、手術室のドアを閉めます。
  4. オイルボトルにMMCオイル(約80mLまで)を補充し、廃液を廃ボトル内の廃液を空にしてから使用してください。
    手記： 廃液は通常有機廃棄物です。廃棄の際は地域の法律および規制を参照してくださいが、実験設定に基づいて変更される場合があります。

2. MMCにおける成長曲線の測定

  1. 最初の細菌溶液の準備
    1. 関連する標準規制に従って、ルリア・ベルターニ(LB)培地を調製し、121°Cで15分間オートクレーブします。
      手記： LB培地の成分:NaCl(10 g / L)、酵母エキス(5 g / L)、およびトリプトン(10 g / L)。
    2. 大 腸菌(大腸菌) MG1655株をグリセロールストックから取り出し、10 mLのLB培地を含む50 mLの振とうフラスコで37°Cの振とうインキュベーター(200 rpm)で5〜8時間培養します。
      手記： 栽培時間は特定の株によって異なります。対数周期/相で株を培養するのが最適です。
    3. 培養した 大腸菌 MG1655溶液を新鮮な培地で0.05〜0.1の600ナノメートル(OD600)の光学密度に希釈して、最初の細菌溶液(約10 mLを調製)を得る。
  2. [ 初期化] をクリックして、MMC を初期化します。初期化インターフェースが表示されたら、培養温度を37°C、光電信号値を0.6に設定します(図2A)。初期化には約 20 分かかります。
  3. 初期化中に紫外線(UV)ランプ(波長254 nm)をオンにします。
  4. 最初の細菌溶液とMMCオイルを試薬ボトルに注入します。
    1. クリーンベンチで滅菌した試薬ボトルを取り出し、キャップを締めます。
    2. 10 mLの滅菌シリンジを使用して、サイドチューブのシリンジニードルから3〜5 mLのMMCオイルを注入します。試薬ボトルをゆっくりと傾けて回転させ、オイルが内壁に完全に浸透するようにします。
    3. 初期菌液を約5mL注入し、再度5〜7mLのオイルを注入して試薬ボトルを満たします。
    4. 独立したクイックコネクタAを引き出し、試薬ボトルのクイックコネクタAをクイックコネクタBに挿入して、サンプル注入操作を完了します(図3A)。
  5. 初期化が終了するのを待ってから、UVランプ(波長254nm)を消します。
  6. 手術室のドアを開け、試薬ボトルを金属浴に入れます。
  7. チップのC2コネクタと試薬ボトルのクイックコネクタAを引き出します。試薬ボトルのサイドチューブコネクタをC2コネクタに接続し、トップチューブコネクタをO2コネクタに接続します。次に、手術室のドアを閉めます。
  8. [ 成長曲線] をクリックして、成長曲線測定の機能を選択します(図2A)。パラメータ設定インターフェイスで、 数値 を15として入力し、 OD検出 スイッチをオンにして、 波長 を600nmに設定します。[ 開始 ] をクリックして、液滴の生成を開始します。所要時間は約10分です。手記： ここで、 数値 は生成される液滴の数を指します。 波長とは 、検出するODの波長を指します。実験要件に応じて、 数 (最大200)と 波長 (350〜800 nm)を設定します。
  9. メインインターフェイスに「C2とO2の間の試薬ボトルを取り外し、完了後にOKボタンをクリックしてください」というポップアップウィンドウが表示されたら、操作室のドアを開けて試薬ボトルを取り出し、C2とO2コネクタを接続します。
  10. ドアを閉め、ポップアップウィンドウの[ OK ]ボタンをクリックすると、液滴が自動的に培養され、OD値が検出されます。
    手記： MMCは、液滴が光ファイバープローブを通過するとOD値を検出します。したがって、検出期間は発生する液滴の数によって異なります。
  11. 成長曲線が定常相に達したら、[ データエクスポート] ボタンをクリックしてODデータをエクスポートします。データ保存パスを選択し、栽培期間中に記録されたOD値を.csv形式でエクスポートし、適切なソフトウェア(Microsoft Excelなど)で開くことができます。次に、マッピングソフトウェア(EXCELやOrigin 9.0など)を使用して成長曲線をプロットします。
    手記： 栽培プロセス中は、いつでも [データエクスポート ] をクリックして、現在のすべての液滴の OD データをエクスポートできます。

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結果

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図1:MMCの構造と必須ツール。 (A)MMCの外部および操作チャンバー。(B)MMCのマイクロ流体チップ。チップには7つのチャネル(C1-C6およびCF)があります。(C)試薬ボトル。トップチューブとサイドチューブがあります。試薬ボトルにサンプルを注入する前に、まずシリンジニードルをクイックコネクタAに取り付け、次にクイックコネクタAをサイドチューブに接続します。(D) マイクロ流体チップの取り付け。マイクロ流体チップは台座に取り付けられています。次に、7つのチャネル(C1-C6およびCF)がそれぞれM...

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 μm PVDFフィルターメンブレンメルク・ミリポア株式会社SLGPR33RBMMCオイルを滅菌する
4°C冷蔵庫ハイアールBCD-289BSW試薬保管用
寒天ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー214010固体プレートの準備用
クリーンベンチ北京東連Har Instrument Manufacture Co.、Ltd.DL-CJ-インド無菌運転とUV滅菌用
コンピュータレノボE450ソフトウェアのインストールとMMC制御
恒温培養器上海qixin科学機器有限公司LRH 250固体培地を用いた微生物培養用
電子天びんオハウスAR 3130試薬計量用
EPチューブサーモフィッシャー1.5ミリリットル液滴収集用
冷凍チューブサーモフィッシャー2.0ミリリットル菌株保存用
グリセロール一般試薬G66258A菌株保存用
高圧蒸気滅菌ポット三洋電機MLS3020オートクレーブ滅菌用
微生物微小液滴培養システム(MMC)洛陽TMAXTREEバイオテクノロジー株式会社MMC-I成長曲線の決定と適応進化の実行参考にしてください http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
マイクロ流体チップ洛陽TMAXTREEバイオテクノロジー株式会社MMC-ALE-OD様々な液滴操作に対応。http://www.tmaxtree.com/en/ を参考にしてください
MMCオイル洛陽TMAXTREEバイオテクノロジー株式会社MMC-M/S-OD液滴マイクロ流体工学のための油相http://www.tmaxtree.com/en/ を参考にしてください
NaCl一般試薬G81793JLB培地の成分
ペトリ皿コーニング株式会社90ミリメートル固体培地の調製用
ピペットエッペンドルフ2.5 μL、10 μL、100 μL、1000 μLリキッドハンドリング用
クイックコネクタA洛陽TMAXTREEバイオテクノロジー株式会社—各ジョイントの接続用。http://www.tmaxtree.com/en/ を参考にしてください
試薬ボトル洛陽TMAXTREEバイオテクノロジー株式会社MMC-PCBです細菌溶液と試薬のサンプリングと保管。http://www.tmaxtree.com/en/ を参考にしてください
シェイクフラスコユニオンバイオテック50ミリットル微生物培養用
振とうインキュベーター上海スクン工業有限公司SKY-210 2Bシェイクフラスコでの微生物培養用
注射器江蘇志宇医療指導有限公司10ミリリットル液体を抽出し、試薬ボトルに注入します
シリンジ針OUBEL金物店22グラム内径は0.41mm、外径は0.71mmです。
トリプトンオキソイド株式会社LP0042LB培地の成分
超低温冷蔵庫SANYO超低MDF-U4086Sひずみ保存用(-80°C)
紫外可視分光光度計ゼネラル・エレクトリック・カンパニーウルトロスペック3100プロOD値の測定用
酵母エキスオキソイド株式会社LP0021LB培地の成分

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