糸状シアノバクテリウムPhormidium lacunaにおける自然形質転換とGFP発現

要約

出典: Weber、N.、 et al.、 糸状シアノバクテリウム Phormidium lacunaの自然な形質転換、タンパク質発現、および凍結保存。 J. Vis. 経験。 (2022年)

このビデオでは、プラスミドDNAを使用して糸状シアノバクテリアの自然形質転換を行い、相同組換えによって安定したGFP発現と抗生物質耐性を達成する手順について説明します。

プロトコル

1. 自然な形質転換とGFP発現

手記： 形質転換は、大 腸 菌(大腸菌)で増殖するプラスミドベクターに基づいています。pGEM-TまたはpUC19をバックボーンベクターとして使用できます。スーパーフォルダーグリーン蛍光タンパク質(sfGFP)発現のベクターの例は、代表的な結果のセクションに記載されています。

1. 無菌実験室条件下で無菌材料を使用してすべての手順を実行します(クリーンベンチ、無菌ガラス器具)。
2. 2つの250 mLフラスコに2 x 50 mLのf / 2液体培地に、2 x 1 mLの Phormidium lacuna (P.lacuna)フィラメントを連続培養で接種します。白色光(50μmol ^{m-2 s-1})で攪拌(水平回転、50 rpm)下で25°Cで~5日間培養します。
3. 製造元の指示に従って、MIDI調製キットを使用して~200 μgの形質転換ベクターDNAを調製します。
4. 100 mLの P.ラクナ細胞 懸濁液( 材料表を参照)を10,000 rpmで3分間均質化します。750 nmで外径を測定します(望ましい値= 0.35)。
5. 細胞懸濁液を6,000 × gで15分間遠心分離します。上清を取り除き、残りの液体と追加のf / 2⁺ 培地の800 μL(残留液体とフィラメントを含む総体積)にペレットを懸濁します。
6. 120 μg/mLのカナマイシンを含む8つのf / 2 ⁺ バクト寒天プレート(直径10 cm)を取ります。各寒天プレートの中央に10μgのDNAをピペットで移します。すぐに100 μLの細胞懸濁液を各寒天プレートの中央(DNAの上)にピペットで入れます。
7. 余分な液体を蒸発させるために、蓋なしで寒天プレートをクリーンベンチに置いてください。プレートを閉じ、25°Cの白色光で2日間培養します。
8. 接種ループを備えた各寒天プレートのフィラメントを、120 μg/mL カナマイシンを含むいくつかの新鮮な f/2⁺ バクト寒天プレートに分配します。プレートを25°Cの白色光で培養し、顕微鏡で培養物を定期的にチェックします。
9. 顕微鏡下で7〜28日後に生きた形質転換フィラメントを特定します。他のフィラメントとは異なる、健康的で緑色のフィラメント (図1) を探してください。これらの緑色のフィラメントを識別できる場合は、次のステップに進みます。それ以外の場合は、プレートをさらに7日間保管してください。
10. 鉗子を使用して、これらの同定された生きたフィラメントを、250 μg/mLのカナマイシンを含む50 mLの液体f / 2 ⁺ 培地に移します。シェーカーで25°Cの白色光で培養します(水平回転、50rpm)。最大4週間成長を観察します。
11. フィラメントを250 μg/mLのカナマイシンを含む寒天培地に戻し、フィラメントが成長するのを待ちます。数日後、シングルフィラメントを高濃度のカナマイシン(500 μg/mLなど)を含む新鮮な寒天プレートに移します。元のプレートを保管してください。
12. フィラメントが液体培養または寒天で高濃度のカナマイシンで増殖していることを確認します。カナマイシン濃度を再び上げて、分離をスピードアップします。手記： 形質転換された P. lacuna は、最大 10,000 μg/mL のカナマイシンで増殖します。他の種はそのような高濃度に耐えられないかもしれません。
13. GFP発現の場合:蛍光顕微鏡で対物レンズの倍率を40倍または63倍に設定して観察します。明視野透過像と蛍光像を撮影します。GFPには、励起に470nmバンドパス、発光に525nmバンドパス、495nmビームスプリッター、初期露光時間500msの設定を使用します。
14. 飽和強度を避けて、鮮明な蛍光シグナルを得るために露光時間を調整します。すべてのサンプルに同じ設定を使用するようにしてください。
15. 野生型フィラメントも蛍光を表示するため、このバックグラウンド蛍光について上記と同じ設定で画像をキャプチャします。注: GFPを発現する株は、より高いシグナルを持っている必要があります。それ以外の場合は、GFP を発現していません。
16. 蛍光画像の露光時間とピクセル強度に基づいて、さまざまなフィラメントのGFP含有量を計算して比較します。

結果

図 1. 形質転換後5週間のPhormidium lacunaフィラメントsfGFP発現ベクターpMH1を使用しました。選択は、120 μg/mL のカナマイシンを含む f/2 培地で行われました。緑がかったフィラメントは耐性があり、生きています。他のフィラメントは死んでしまった。スケールバー = 100 μm

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バクト寒天	オットーノルワルド	214010
蛍光顕微鏡 ApoTome	ツァイス
蛍光顕微鏡 Axio Imager 2	ツァイス
カナマイシン	シグマ・アルドリッチ	25389-94-0
顕微鏡 DM750	ツァイス
Midi 調製プラスミド抽出キット NucleoBond Xtra Midi キット	Macherey-NAGEL GmbH &; Co. KG	REF740410.50
光源、蛍光管 L18W/954 昼光	オスラム		シアノバクテリアの培養
光源、LEDパネル XL 6500K 140 W	ブルームスター	該当なし	シアノバクテリアの培養
ペトリ皿ポリスチロール、100 mm x 20 mm	メルク	P5606-400EA
ペトリ皿ポリスチロール、60 mm x 15 mm	メルク	P5481-500EA
ピペットマン 100-1,000 μL	ギルソン	商品コード: FA10006M
ピペットマン 10-100 μL	ギルソン	商品コード: FA10004M
プラスチックピペット 10 mL、滅菌	グライナー	607107
シェーカー ユニマックス 2010	ハイドルフ・インストゥルメンツ		栽培用
プラスチックチューブ、滅菌、50 mL	グライナー	227261
Ultraturrax サイレントクラッシャー M	ハイドルフ・インストゥルメンツ		ホモジナイザー
F/2+ 液体培地	f/2-培地、NaNO₃およびNaH₂PO₄が10倍に増加(0.88 mM NaNO₃、36 μM NaH₂PO₄
F/2+-寒天	3%(w / v)バクト寒天、人工海水、0.1%(v / v)微量元素溶液、0.05%(v / v)ビタミン溶液、8.8 mM NaNO₃、0.36 mM NaH₂PO₄