相同組換えによるシアノバクテリアにおける抗生物質マーク変異体の生成

要約

出典:Lea-Smith、DJ、et al。モデルシアノバクテリア種におけるマーク及びマーカーレス変異体の生成J. Vis. 経験。(2016年)

このビデオは、シアノバクテリアに抗生物質でマークされた変異体を生成する方法を示しています。プロトコルはシアノバクテリアの培養から始まり、続いて遠心分離と表面の線毛を保存する洗浄ステップが続きます。次に、相同配列に隣接する抗生物質耐性遺伝子を運ぶプラスミドを導入します。インキュベーション中、プラスミドは線毛を介して内在化され、相同組換えによって標的遺伝子を置換します。抗生物質の選択と再除去は、変異株を単離および精製するために使用されます。

プロトコル

1. 培地の調製
   1. Castenholz(1988)に従って、青緑培地11(BG11培地)を調製します。
      1. 100x BG11、微量元素、および鉄ストックの原液を調製します(表1)。
      2. リン酸塩ストック、炭酸ナトリウム(Na₂CO₃)ストック、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-2-アミノエタンスルホン酸(TES)緩衝液、および重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)の別々の溶液を調製します(表1)。
      3. リン酸塩とNa₂CO₃のストックをオートクレーブします。TESバッファーとNaHCO₃を0.2 μmフィルターでろ過滅菌します。
      4. 水976ml、100x BG1111111ml、微量元素1ml、鉄ストック1mlを混ぜ合わせてBG11を調製し、溶液をオートクレーブします。この溶液が室温まで冷却された後、1 mlのリン酸塩ストック、1 mlのNa₂CO₃ストック、および10 mlのNaHCO₃を加えます。
      5. BG11固体培地の場合、寒天15gと水700mlを1つのフラスコに加えます。2番目のフラスコに、チオ硫酸ナトリウム(Na₂S₂O₃)3g、水226ml、100x BG111111ml、微量元素1ml、鉄ストック1mlを加えます。両方の溶液をオートクレーブします。これらの溶液が室温....

結果

図1:シネコシスティスにおけるcpcC1およびcpcC2などのマークおよびマークされていないノックアウトを生成するためのプラスミド構築。(.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ナノ₃	シグマ	S5506
MgSO₄・7H₂O	シグマ	230391
CaCl₂	シグマ	C1016
クエン酸	シグマ	C0759
Na₂EDTAの	漁夫	EDT002
H₃BO₃	シグマ	339067
MnCl₂・4H₂O	シグマ	M3634
ZnSO₄・7H₂O	シグマ	Z4750
Na₂MoO₄・2H₂O	シグマ	331058
CuSO₄・5H₂O	シグマ	209198
Co(NO₃)₂・6H₂O	シグマ	239267
クエン酸第二鉄アンモニウム	シグマ	F5879
K₂HPO₄	シグマ	P3786
Na₂CO₃	漁夫	SODC001
TESの	シグマ	T1375
NaHCO₃	漁夫	SODH001
ヘペス	シグマ	H3375
シアノコバラミン	シグマ	47869
Na₂S₂O₃	シグマ	72049
バクト寒天	BDの	214010
蔗糖	漁夫	SUC001
ペトリ皿 90 mm トリプルベント	グライナー	633185
0.2 μmフィルター	ザルトリウス	16534
100mlコニカルフラスコ	パイレックス	CON004
パラフィルム M 100 mm x 38 m	ベミス	FIL003
Phusion 高忠実度 DNA ポリメラーゼ	Phusion	F-530型
アガロース	メルフォード	MB1200
DNA精製キット	モビオ	12100-300
制限エンドヌクレアーゼ	NEB
T4リガーゼ	サーモサイエンティフィック	EL0011
ルリア・ベルタニ・ブロス	インビトロゲン	12795-027
MESの	シグマ	M8250
硫酸カナマイシン	シグマ	60615
アンピシリン	シグマ	A9518
GeneJETプラスミドミニプレップキット	サーモサイエンティフィック	K0503
14ml丸底チューブ	BDファルコン	352059
グリセロール	シグマ	G5516
DMSOの	シグマ	D8418