出典: アリアス、S. L. 、他 酸化鉄ナノ粒子を用いた機能化磁性細菌ナノセルロースの製造。 J. Vis. Exp. (2016年)
このビデオは、 グルコナセトバクター・キシリヌスが産生する細菌のナノセルロースペリクル内で磁鉄鉱ナノ粒子を現場合成する方法を示しています。磁性細菌のナノセルロースが鉄イオン注入、アルカリ沈殿、精製によって生成される仕組みを説明しています。
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方法論記事
磁鉄鉱に埋め込まれた細菌ナノセルロースペリクルの生成
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2025年11月28日
この記事について
要約
プロトコル
1. ポリマー被覆鉄酸化物ナノ粒子の合成および細菌ナノセルロース(BNC)膜への沈着
- 高純度の水1,000mlに窒素ガスを泡立てて水中の溶存酸素を除去し、窒素に置き換えます。
- 3ネックの丸底フラスコを使い、鉄(III)塩化六水和物(FeCl3.6H 2O)と塩化鉄(II)四水和鉄(FeCl2·4H2O)を脱酸素高純度の水で希釈した2:1モル比の溶液を準備します。例えば、5.4gのFeCl3.6H 2Oと1.98gのFeCl2·4H2Oを10mlの脱酸素高純度水に使用します。この調製が粘度が高くかき混ぜにくくなった場合は、FeCl3.6H 2O 0.54 gとFeCl2.4H 2O 0.198 gを、20mlの脱酸素高純度水に使用してください。
手記： FeCl2·4H2Oの空気への曝露時間をできるだけ早く計量することで短縮しましょう。3ネックの丸底フラスコに導入したら、窒素ガス供給と凝縮管に接続するまでセプタムストッパーで閉じます。 - 容器の2つの首を使い、窒素ガスの供給を鼻中隔栓に穴を開けて容器の首に固定した針に接続することで、窒素ガスの絶え間ない出入りを確保します。
- 反応物を含む容器に直径15.6mm、厚さ2〜3mmのBNCペリクル1枚を置きます。サンプルが液体に完全に浸かっていることを確認してください。
- 容器の残りのネックをコンデンサーチューブに接続します。さらに、凝縮管の上に無水硫酸カルシウムを充填した乾燥チューブを設置してください。凝縮器の管に水を通してください。
- すべてのガラス継ぎ目を真空グリースで密封してください。
- 溶液をシリコーンオイルバスで80°Cまで加熱し、攪拌用のホットプレートを使ってこの温度を1.10ステップまで保ちます。小さな磁気攪拌棒を使って、350rpmで5分間反応物を混ぜます。BNCが鉄系溶液で適切に含浸され、反応物が完全に溶解していることを確認してください。実験が終わるまで混合物をかき混ぜ続けてください。
手記： 温度計を使ってシリコーンオイルの温度を確認してください。80°Cまで安定しているはずです。 - 攪拌速度を700rpmに上げ、ピペッティング針を使って5分間隔で5mlの水酸化アンモニウム(NH4OH、14%)を10mlの鉄溶液に加えます。針はセプタムストッパーにも穴を開けてあります。水酸化アンモニウムを加えた後、溶液の色は黄色やオレンジから黒色に変わります。
- さらに80°Cでさらに5分間かき混ばし続けます。試料の完全性を維持するために高速攪拌は避けてください。高速、 すなわち1,000rpmを超えると試料が破壊されることがあります。
- 攪拌ホットプレートの温度調節下部を使って溶液の温度を30°Cまで下げ、さらに5分間攪拌続けます。それから、ホットプレートを消します。この時点で、酸化鉄ナノ粒子(IONPs)がBNCメッシュに組み込まれています。
- 混合物を室温(RT)まで冷却し、強力な永久磁石(例:1テスラ)を使って磁性ナノ粒子(MNPs)とBNCを分離します。そのためには、混合物を容器フラスコに移し、磁石を容器に近づけたままMNPとBNCを固定しながら上清液をデキャントします。
手記： 強力な磁石を扱う際は、誤った使用で有害になる可能性があるため注意してください。ステップ(1.12)から(1.14)、(1.16)では、先に(1.1)で準備された脱酸素高純度の水を用いて粒子の酸化を防ぎます。 - MNPとBNCを100mlの水に再懸浮させてください。BNCに強く組み込まれていないMNPをすべて除去するために、溶液を優しく振ってください。磁石でMNPとBNCを固定して上清液を再度デカントします。
- MNPとBNCを水で数回洗浄し、上清液が比色ストリップで測定した中性pH(pH~7)に達するまで続けます。
- 磁気官能化BNC(磁性細菌ナノセルロース(MBNC)をMNPからピンセットで分離し、水で数回洗い流して水が透明になるまで洗い流します。
- MBNCのO/NをUV(110-280nm)にさらして滅菌します。
- 脱酸素高純度の水500mlを120°Cで20分間オートクレーブし、MBNCをこの水20mlに保存します。
- 無菌状態で、サンプルをポリエチレングリコール(PEG)1%に浸し、RT(37°C)で2時間かき混ぜます。この手法は、特に表面に露出したBNC内に堆積した酸化鉄ナノ粒子の生体適合性と安定性を向上させます。PEGコーティングはMBNCの3Dネットワークを通じて配布されます。
手記： 裸のIONPは高い化学活性のため空気中で簡単に酸化されます。PEGは生分解性の物質とみなされていますが、その化学的安定性は水分含有量、pH、温度、酵素の有無、活性酸素種、活性窒素種などの適用された生物学的条件に依存します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| グルコアセトバクター・キシリヌス | ATCC | 700178 | |
| 鉄(III)塩化六水和物 | シグマ・オルドリッチ | 236489-100G | |
| 水酸化アンモニウム | マクロン・ファイン・ケミカルズ | 6665-46 | |
| ポリ(エチレングリコール)、平均ミュロン400 | シグマ・オルドリッチ | 202398-250G | |
| 鉄(II)塩化四水和物 | シグマ・オルドリッチ | 44939-250G | |
| 無水硫酸カルシウム | W.A.ハモンド・ドライエライト | 13001 | |
| 高真空グリース | シグマ・オルドリッチ | Z273554-1EA | |
| pHテストストリップ | シグマ・オルドリッチ | P4786-100EA | |
| 丸底の三ネックアングル型蒸留フラスコ | シグマ・オルドリッチ | CLS4965250 | |
| オイルバス用のシリコーンオイル | シグマ・オルドリッチ | 85409-250ML | |
| 乾燥チューブ | ケムグラス | CG-1295-01 | |
| セプタムストッパー、スリーブタイプ | ケムグラス | CG-3022-98 | |
| 磁気攪拌棒 | ケムグラス | CG-2001-05 | |
| コンデンサー | ケムグラス | CG-1218-01 | |
| 温度コントローラー | ブリスクヒート | SDC120JC-A | |
| かき混ぜホットプレート | フィッシャー・サイエンティフィック | 11-100-49SH |
