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1. ラベルフリーのCaenorhabditis elegans(C. elegans)生存スコアリング(LFASS)、熱ショックおよび酸化アッセイセットアップ(13日目〜14日目)
- ミミズの発達段階を評価してください。>90%のワームがL4に達したら、最大10 mLの滅菌M9溶液で15 mLの円錐形チューブにミミズを採取します。
- ミミズを4°Cで142gで2分間2分間、4°Cで徹底的に洗浄し、上澄液を取り除き、洗うたびに新鮮な滅菌M910mLを加えて大腸菌OP50菌を除去します。ミミズペレットを10 mLのM9に再懸浮させます。
- 50μLのワーム溶液を、950μLのM9を含む低表面結合チューブに移します。チューブの内容物を優しく混ぜてミミズの沈着を防ぎ、湿らせた低結合ピペットの先端を素早く使い、3〜4滴の10μL滴をガラススライドまたは線虫成長培地(NGM)プレートに移します。立体顕微鏡で16倍拡大でミミズの数を数えます。3〜4滴のミミズ数を平均し、ミミズ溶液中のミミズ数を1マイクロリットルあたり決定します。
- 10 mLチューブ内のワーム濃度を調整し、8 μLで約120個のワームにします。もし解答がステップ1.2で準備されていた場合、濃度が十分でない場合は、ワームをスピンダウンし、M9を適切に除去して8μLあたり120個のワームに到達させます。
- マルチチャネルピペットまたはリピピペットを用いて、事前に準備された8本の96ウェルNGMアガロースプレートの各ウェルに8μLのワーム溶液(~120ワーム)を移します。ミミズの損失を抑えるために、保持率の低い先端を使うことを心がけてください。また、大型の成虫が機械的ストレスを抑えるために先端を切断する必要がある場合もあります。
手記： このアッセイは、確実に機能するために最低でも30匹の健康なミミズが必要ですが、1井戸あたり約100匹のミミズが最も効果的です。 - ミミズと細菌シードされた96ウェルのNGMアガロースプレートを25°Cで36時間培養します。
- 12〜24時間の間にプレートをチェックし、ミミズが常に満ちているか確認してください。再給餌が必要な場合は、細菌を15°Cで保存した96ウェルの細菌アレイプレート内に再懸濁させ、36時間の潜伏期間終了前に飢餓リスクがある96ウェルのNGMアガロースプレートに最大10μLの細菌溶液を加えます(飢餓したミミズは結果が大きく異なります。 これは非常に重要です)。
手記： 15日目には以下の手順を実施する必要があります。アッセイ開始前に、読み取り高さの最適化が必要になる場合があります。最適な読み取り値は井戸底部から20〜50μm上方で達成されます。これはプレートリーダーのモデルによって異なります。Zスキャン対応のものもあれば、手動で高さ入力できるものもあります。最適な高さは、最も高い青色蛍光信号(365 nm/430 nm)が検出されるレベルに設定します。一部のプレートリーダーは、接着細胞アッセイに最適化された固定高さで動作し、LFASSアッセイには理想的でない場合もあります。 - 36時間後、96ウェル板の各ウェルに30μLのM9を注入します。
手記： 熱応力アッセイでは、プレートリーダーがアッセイを行うために必要な温度に達している必要があり、事前に電源を入れておく必要がある場合があります。現在のプロトコルでは殺菌速度を最大化するために42°Cが使われていますが、30°C以上の他の温度にもこの方法は適用されます。 - 約20μLのワームをセットレイアウトに従って384ウェルプレートに移し、低保持チップを使用しています(大型ワームが成虫の機械的ストレスを軽減するためにチップの端を切り落とすことも検討してください)。
手記： 本研究では、ここで述べた2つのアッセイ(熱応力と酸化応力)に異なるプレートリーダー設定が用いられているため、これら2つのアッセイ用サンプルは同じ384ウェルプレートでメッティングしてはなりません。 - プレートリーダーが正しく設置されていることを確認してください(表1参照)。
- 384ウェルのプレートにさらにM9を加え、最終的な1ウェルあたり60μLの容量を目指します。熱応力アッセイにはM9を40 μL、テルトブチルヒドロペルオキシド(t-BHP)誘発酸化ストレスには、34 μLのM9を6 μlの t-BHPに加えます。
- t-BHPを加えてから2分以内にアッセイを開始してください(理想的にはすべてのワームを同時にt-BHPにさらし、アッセイ時間分解能は2分です)。不可能であれば、タイマーを使ってアッセイ開始前にt-BHPピペッティングにかかる時間を推定し、後で死亡推定時間を中央値調整できるようにします。
- プレートを透明な蓋で閉じます。384ウェルプレートの縁をマスキングテープで密封し(プレートと蓋にテープで貼り)、テープが蓋やプレートの下に入らないように注意してください。メスで蓋とプレートの間にテープを割り込み、空気交換を可能にしつつ、アッセイ中の蒸発を最小限に抑えました。
- プレートをプレートリーダーに差し込み、走り始めます。365nmで励起し、435nmで6〜12時間ごとに2分ごとに放射を検出することを目標にしてください(表1)。
手記： 通常、42°Cの熱ストレスアッセイは6時間、7%のt-BHP酸化ストレスアッセイは8時間で十分です。
表1:酸化および熱ストレスアッセイ設定。本研究で使用された蛍光プレートリーダーを用いた酸化(A)および熱(B)応力アッセイの設定例。