出典: Becker, B., 他リシン毒素A連鎖(RTA)輸送に必要な細胞成分を特定するための簡易蛍光基レポーターアッセイ。 J. Vis. Exp. (2017年)。
このビデオは、ニッケル系親和クロマトグラフィーを用いてポリヒスチジン標識組換えタンパク質の精製を実演しています。超音波検査による細菌の溶解、溶解液の澄清とろ過、イミダゾールを用いた選択的結合および標的タンパク質の浸出など、主要な手順を概説しています。
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方法論記事
組換え細菌タンパク質の精製のための親和性クロマトグラフィー技術
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2025年11月28日
この記事について
要約
プロトコル
1. 親和性クロマトグラフィーによるHisタグ付きRTAの精製
- 氷上で細胞を超音波処理する方法は以下の通りです:15秒パルス(20ミクロン)、30秒の停止。このステップを5回繰り返します。
- 遠心分離機セルを21,000 x g、4°Cで15分間溶解し、無菌シリンジフィルターシステム(0.2 μmの孔径)で上清液をろ過します。
手記： 超音波検査に成功したサンプルの細胞ペレットは透明な境界を示します。 - 5mLのNi2+基親和カラムを備えた自動精製システムを用いて、無菌ろ過された大腸菌上清液からHisタグ付きRTA画分を精製 します。一般的には、1 mL/minの洗脱速度を用い、精製システム全体を冷却して毒素結合の非効率化や毒素活性の喪失を防ぎます。
手記： 効率的なRTA精製のパラメータは 表1に記載されています。- 簡単に、親和性カラムを20mLの結合バッファーで平衡させて貯蔵バッファーを除去します。無菌ろ過された上澄液を注射器で親和性カラムに塗布します。
- カラムを25〜35mLの結合バッファーで洗浄し、カラムから結合していないタンパク質を除去します。280nmのUV吸収が初期のUV値に近づくまで洗浄工程を繰り返します。
- 20-35 mLの洗脱バッファー(500 mMイミダゾール、500 mM NaCl、20 mM KH2PO4、pH=7.2)で浸したRTAを溶出し、サンプルを氷上に保管します(図1A および 図1B)。
手記： RTA分画の洗脱はUV吸収の増加によって特徴づけられます。非特異的結合タンパク質による汚染を防ぐため、この分画のみを採取することにご注意ください。
表1:カラムベースの親和性精製および脱塩に用いられるパラメータ。関連するすべてのカラム設定(例:流量、溶出バッファー濃度、平衡、洗浄ステップ時間)および測定パラメータ(例:導電率やUV吸収)の一覧。
| 親和性クロマトグラフィーパラメータ | ||
| 測定パラメータ | 紫外線(280nm)、洗脱バッファー濃度、コンダクタンス | |
| 設定 | 可変/単位 | 価値 |
| 流量 | mL/min | 1 |
| 最大カラム圧力 | MPa | 0.35 |
| 波長 | 海里 | 280 nm |
| バインディングバッファ | ポンプ位置 | ある |
| 洗脱バッファ | ポンプ位置 | B |
| 開始濃度洗脱バッファー | % | 0 |
| システム体積補償 | ミリリットル | 10 |
| カラム平衡 | ミリリットル | 20 |
| スーパーループ/シリンジを通じたサンプル注入 | ミリリットル | 細胞溶解液の容積 |
| 洗浄ステップ | ミリリットル | 20-35 |
| 洗脱ステップ | ミリリットル | 20-35 |
| 濃度洗出バッファー | % | 100 |
| 20%EtOHを用いたカラムの再校正 | ミリリットル | 50 |
| 脱塩パラメータ | ||
| 測定パラメータ | UV(280nm)、コンダクタンス | |
| 設定 | 可変/単位 | 価値 |
| 流量 | mL/min | 4 |
| 最大カラム圧力 | MPa | 0.35 |
| 波長 | 海里 | 280 nm |
| バインディングバッファ | ポンプ位置 | ある |
| 洗脱バッファ | ポンプ位置 | B |
| 開始濃度洗脱バッファー | % | 0 |
| システム体積補償 | ミリリットル | 10 |
| カラム平衡 | ミリリットル | 20 |
| スーパーループ/シリンジを通じたサンプル注入 | ミリリットル | 細胞溶解液の容積 |
| 脱塩バッファー注入(0.8Mソルビトール) | ミリリットル | 100 |
| 20%EtOHを用いたカラムの再校正 | ミリリットル | 50 |
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結果
図1:pET-RTA(His)6を含む大腸菌細胞または空ベクター対照群の代表的な親和性クロマトグラフィーおよび脱塩結果。(A) ベクターpET24-RTA(His)6からRTA(His)6を発現する大腸菌細胞溶離液サンプルの典型的な精製グラフ。青い曲線は、アミノ酸の芳香族環であるTrp、Tyr、Cysによる280 ...
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 分光光度計 Ultrospec 2100 pro | アマルサム | ||
| ソニップレップ150 | MSE | 旧モデル、他のモデルも入手可能です | |
| フルロスカン・アセント | サーモ・サイエンティフィック | 5210470 | 古いモデル、もう入手できません |
| ÄKTAPurifier | サーモ・サイエンティフィック | 28406266 | 製品は生産終了し、置き換えられます |
| HisTRAP HP列 | GEヘルスケア | 17-5248-02 | |
| HiTRAP脱塩カラム | GEヘルスケア | 11-0003-29 | |
| ミディサート無菌フィルター | サルトリウス | 16534K | 0.2 μm の孔径 |
| BCAタンパク質アッセイキット | 刺す | 23225 | |
| 660nm分析キット | サーモ・サイエンティフィック | 22660 | |
| 96個のウェルプレート | サーモ・サイエンティフィック | 260860 |
