セルロース産生細菌からの細菌ナノセルロースペリクルの製剤

要約

出典:アリアス、S. L.、他酸化鉄ナノ粒子を用いた機能化磁性細菌ナノセルロースの製造。 J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオは、マンニトールを含む栄養培地でセルロース産生細菌を培養することでナノセルロースを生成する方法を示しています。細菌はマンニトールをグルコースに代謝し、グルカン鎖として重合・押し出され、セルロースシートに結晶化して空気と液体の界面で三次元マトリックスを形成します。得られたゼラチン質のペリクルは収穫され、アルカリ性および水洗浄液で精製され、オートクレーブで滅菌されてさらなる用途に備えます。

プロトコル

1. 細菌ナノセルロース(BNC)の調製

手記： 特に記載がない限り、すべての工程は無菌条件下で行われます。

1. 培養培地を準備します。
   1. 酵母エキス25g、ペプトン15g、マンニトール125.0g、高純度水500mlを組み合わせて、液体培地500mlを準備します。この混合物を120°Cで20分間オートクレーブし、4°Cで保存します。
   2. 半固体培地100mlを、15gの寒天と5.0gの酵母エキス、3.0gのペプトン、25.0gのマンニトール、100mlの高純度水を加えて調合します。この混合物を120°Cで20分間オートクレーブします。オートクレーブしたら、5mlの混合物を90mm×16mmのプラスチック製ペトリ皿に浸します。溶液を4°Cでゲル化させ、この温度で保存して使用します。
2. 凍結乾燥バイアルで保存された グルコアセトバクター・キシリヌス 株(G. xylinus) 株は、製造元の指示に従って1mlの液体培地を加え、ピペットで上下に再水和します。
3. 半固体培地を含むペトリ皿には、接種ループを使って細菌の懸濁液を少量の滴で接種します。ループを皿の端から中央にジグザグに動かして、接種装置がペトリ皿全体を覆うようにしてください。
4. ペトリ皿は26°CでCO2なしのインキュベーターで72時間孵化します。孵化期間が終わると、小さな白いコロニーが見えます。コロニーをすぐに使わない場合は、蓋をパラフィルムで密封し、皿を逆さまにして4°Cで保存してください。コロニーはその方法で最大6ヶ月間保存できます。
5. 24ウェルの組織培養プレートの各ウェルに2mlの液体培養培地を移します。接種されたペトリ皿から接種針で2つのコロニーを取り、組織培養皿の最初のウェルに入れます。残りの23井戸についても同じ手順を繰り返します。
6. 組織培養プレートを30°Cで7日間培養します。これにより、直径16mm、厚さ約2〜3mmの合計24個のBNCペリクルが得られ、図 1に示されています。手記： 培養期間中は、例えばプレートを振って細菌培養液を乱してはいけません。培養期間中、 G. xylinus はグルコピラノース糖分子を押し出し、空気-液体界面に高分子結晶メッシュを形成します。これは静的な培養条件下でフラスコの形状と大きさを採用します。このポリマーマトリックスは細菌ナノセルロース(BNC)として知られ、培養期間の終わりに目立つ。
7. 培地からBNCペリクルを採取し、1%ナオホース溶液200mlで50°Cで1時間滅菌し、G . xylinusの痕跡をすべて除去します。オプションとして、磁気バーと攪拌板を使って300rpmで攪拌することも可能です。NaOH溶液は捨て、新たに調製された1%のNaOH溶液を200ml加えます。同じプロセスをもう一度繰り返すか、溶液中のBNCペリクルが半透明になるまで繰り返します。
8. BNCペリクルは水で3回すすいで、RTで高純度の水に保存してください。BNCペリクルは完全に水に浸し、乾燥させないようにしてください。
9. BNCペリクルを121°Cで20分間オートクレーブ処理します。注:Märtsonらがラットを対象に実施した 生体内 皮下試験では、着床60週後もBNCの劣化兆候は見られませんでした。実際、BNCは自然界では微生物や真菌の酵素によって分解されやすく、哺乳類には存在しません。一方で、BNCの生分解性は、 生体内でマイクロフィブリルネットワークを弱める機械的、化学的、生物学的プロセスの結果である場合もあります。

結果

図1。細菌ナノセルロースの巨視的側面。 BNCペリクルは11日間の潜伏期間の後に得られ、これはおおよそ。厚さは3mmです。潜伏期間は、意図された用途の要件によって異なります。

材料