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1. 化学薬品および機器の準備
1. 1%の六核リン酸ナトリウム(SHMP)(NaPO3)n溶液を500ml作成し、オートクレーブで滅菌します。
2. ニトロセルロース(NC)フィルター(孔径0.22μm、直径47mm)を密閉ガラスのペトリ皿でオートクレーブして滅菌します。
3. NCフィルター(孔径0.22μm、直径25mm)を密閉ガラスペトリ皿でオートクレーブして滅菌します。
4. 無菌50mlチューブ(キャップ付き)(サンプル1本)の空重さを計量し記録する。
5. Tris-EDTAバッファー(TE-バッファー)を1回準備します:10 mM Tris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)と1 mM EDTAバッファーの溶液を作ります。pHを8に調整し、オートクレーブで滅菌します。
6. リソザイム溶液(20 mg/ml)を1 mlのTEバッファーに溶かして製備します。理想的には、毎回新鮮に仕上げてください。4°Cで保存し、1週間以内に保存してください。
7. 蒸留水に塩化ナトリウム(NaCl)8 g/Lを溶かして生理用溶液を調製します。オートクレーブで滅菌してください。
2. バイオマスと堆積物の分離
1. エタノール燃焼金属スクープを用いて、あらかじめ計量された滅菌50mlチューブに3gの堆積物サンプルを加えます。汚染を避けるために、清潔でUV消毒されたバイオセーフティキャビネット内で実施してください。
2. 無菌グラデーションビュレットを用いて、1%の滅菌(オートクレーブ)SHMP溶液15mlをサンプルに加えます。SHMP溶液は汚染を避けるためにろ過も可能です。
3. 液体分散器/均質剤(例:Ultra-Turraxホモジナイザー)で堆積物およびSHMP溶液を均質化します。使用前に70%エタノールで分散ローターを滅菌またはオートクレーブ処理します。均質化を17,500rpmで1分間実行します。試料を2分間休ませ、同じローター速度で1分間均質化を繰り返します。
4. サンプルを10分間置く。この段階で、最も重い粒子(鉱物)が沈降します。しかし、細胞やサンプルの有機成分は溶液中に残ります。その後、上清液(細胞バイオマスを含む)をきれいな50mlチューブに移し、堆積物ペレットを乱さないように注意してください。
5. 沈殿物ペレットに、滅菌目付きビュレットを使って1%滅菌(オートクレーブ)SHMP溶液15mlを再度加えます。次にステップ 2.3 と 2.4を繰り返します。 この繰り返しにより、堆積物の鉱物成分から細胞や有機粒子が最大限分離されます。この2回目の分離の上清液は、最初の分離の上清液と融合させることができます。
手記： 以下の手順はすべて、上清液(細胞バイオマスを含む部分)に対して行われます。鉱物成分(堆積物ペレット)は廃棄可能です。
6. サンプルを20 x gで1分間遠心分離します。この工程により、生体細胞物質がまだ溶液中に残る間に小さな鉱物粒子が沈殿できるほどのGフォースが増加します。遠心分離後、細胞バイオマスを含む上澄液を清潔な50mlチューブに移します。鉱物ペレットは捨ててください。
7. サンプルの重さを測定して、バイオマスを含む溶液の最終体積を決定します。重量測定により、試料を目盛りシリンダーに移す必要がなくなり、汚染リスクを減らします。
3. フィルター膜上のバイオマス収集
1. ろ過ユニット(直径47mmの膜用)と真空ポンプを準備します。ろ過ユニットはオートクレーブ処理するか、パイレックスガラスの場合は70%エタノールを噴霧し、ブンゼンバーナーで焼き付けて滅菌します。プロトコルを続ける前に冷ます。
2. エタノール炎で滅菌された鉗子を使って、ろ過ユニットに滅菌NC膜を追加します。
3. ステップ 2.6の上清サンプルの半分を膜ろ過ユニットに加え、真空ポンプを使って膜上の細胞を採取します。
4. 液体がフィルターを完全に通過したら、真空ポンプを停止し、エタノール火で滅菌された鉗子で膜を慎重に取り外します。膜を無菌のペトリ皿に入れます。
1. エタノールで焼き付けた滅菌ハサミで膜を半分に切る。膜のそれぞれの半分を別々の2mlチューブに追加します。膜の半分はDNA抽出と細菌群集全体の分析に使用されます。フィルターのもう半分は-80°Cで保管され、バックアップとして使われます。
5. 新しいNC膜をろ過ユニットに設置し、ステップ 2.6のサンプル体積の後半からバイオマスを真空ポンプで採取します。
6. 液体がフィルターを完全に通過したら、真空ポンプを停止し、エタノール火を吹き付けた滅菌された鉗子で膜を慎重に取り外します。膜全体を別の2mlチューブに入れます。このサンプルは、栄養細胞から内胞子を分離するための処理に使用されます。サンプルは使用まで-20°Cで保存できます。
4. 栄養細胞の溶解
1. NC膜上で既に採取したバイオマス上の内胞子を栄養細胞から分離する処理を行う(ステップ 3.6)。
1. 膜が凍結していた場合は、解凍のために10分間RTで放置します。その後、膜を滅菌ペトリ皿に入れ、エタノール火で滅菌したハサミで約4回小さく切ります。その後、すべての膜フィルターの部品を滅菌された2mlチューブに入れます。
2. サンプル膜を含むチューブに1xのTE(Tris-EDTA)バッファー900μl( 1.5参照)を加え、ボルテックスで十分に混合します。この段階で、バイオマスは膜からTEバッファー溶液に取り出されます。
3. チューブを65°Cのインキュベーターに10分80回転置く。その後、チューブをインキュベーターから取り出し、15分間冷ます。
4. 新たに調製したリソザイムを100μl(参照 1.5)を加え、最終濃度2 mg/mlにします。試料が37°Cまで冷える前にリゾザイムを加えないでください。これにより酵素が劣化する恐れがあります。
5. サンプルを37°Cで60分、80回転分の間、リゾザイムが栄養細胞を溶除する最適な条件下でキュベートします。
6. 溶解完了後、3N水酸化ナトリウム(NaOH)250μlと6%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液250μlを加えます。これを加えると、試料の体積は1.5 mlに達し、最終濃度は0.5 N NaOH、最終濃度は1%のSDSとなります。
7. この混合物をRTで60分、80回転ずつインキュベートします。ベースと洗剤を加えることで、最終的な細胞溶解が助けになります。これらの洗剤の濃度は、栄養細胞を溶解する際に胞子を傷つけないよう最適化されています。
8. 直径25mmの膜を保持する無菌ろ過装置を自滅菌で準備します。または(パイレックスガラスの場合は)70%エタノールを噴霧し、バーナーで炎をつけます。冷ますように。
9. エタノール炎滅菌鉗子を使ってろ過ユニットに0.2μmのNC膜(直径25mm)を置きます。
10. ステップ4.7のサンプルを膜に加え、真空ポンプで液体をろ過します。液体が通過したら、真空ポンプを停止します。この段階で、膜に保持されない溶生された栄養細胞物質は除去されます。膜上には内胞子だけが残ります。
11. 残留洗剤を洗い流すために滅菌生理用溶液2mlを加え、真空ポンプで液体をろ過します。
12. 液体が完全にろ過されたら、真空ポンプを停止します。膜はろ過装置にそのまま残してください。