大腸菌における蛍光標識リプレッサーによるタンパク質媒介複製阻害

要約

出典: Mettrick, K. A., Lawrence ら、 蛍光抑制子オペレーターシステムを用いて 大腸菌 における部位特異的複製遮断の誘導。 J. Vis. Exp. (2016年)

この動画では、アラビノース誘導による黄色蛍光色標識タンパク質TetRの発現を用いて、大 腸 菌における部位特異的複製フォーク遮断を示し、染色体TetO配列に結合します。

プロトコル

1. 蛍光抑制子オペレーターシステム(FROS)による複製遮断

1. 複製阻害の誘発
   1. tetOアレイとpKM118をOD₆₀₀nm=01にかけた大腸菌株の新鮮な一晩培養液を、希薄な複合培地(0.1%トリプトン、0.05%酵母抽出物、0.1% NaCl、0.17 M KH₂PO₄、0.72 M K₂HPO₄)で、選択に必要な抗生物質とともに希釈します。
      手記： 選択のためにテトラサイクリンを加えるのはこのシステムと相容れないため避けてください。培養液の体積はサンプルあたり10mlに相当します。例えば、 図1 の実験デザインの培養体積は60mlです。
   2. 30°Cで振って外径₆₀₀ nm=0.05-0.1まで育てます。誘導されていない対照として10mlのサンプルを採取し、残りの培養に0.1%のアラビノースを加えてpKM1からTetR-YFPの産生を誘導します。誘導培養と誘導培養の両方を継続してください。1時間後、蛍光顕微鏡を用いて誘導培養の各細胞内に単一の焦点があるかどうかを確認します。
   3. 誘導細胞がブロックされていることが確認された場合(70%以上の細胞が単一の焦点を持つ)、OD_を600nmで記録し、7.5mlのサンプルを2次元ゲルで分析します。誘導されていない対照培養から同等のサンプルを採取します。

結果

図1:FROS複製ブロックおよび放出実験手順の概要。tetOアレイを持つ 大腸菌 株は30°Cで培養されます。細胞がOD₆₀₀nmで0.05を超えると、アラビノース(ara、0.1%)によってTetR-YFP産生が誘導されます。誘導しない細胞のサブポピュレーションを30°Cでコントロールとして増殖させ続けます。誘導細胞のサンプルは1〜2時間後に蛍光顕微鏡で分析されます。複製が阻害されたことが確認された場合、試験管で示される2次元ゲル分析および生...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリプトン	シグマ・オルドリッチ	16922	成長メディアの構成要素
塩化ナトリウム	VWR	27810.364	成長メディアの構成要素
酵母抽出物	シグマ・オルドリッチ	92144	成長メディアの構成要素
リン酸カリウム一塩基性	シグマ・オルドリッチ	P9791	成長培地の要素;カリウム緩衝成分
リン酸カリウム二塩基性	シグマ・オルドリッチ	P3786	成長培地の要素;カリウム緩衝成分
L-アラビノーズ	シグマ・オルドリッチ	A3256	TetR-YFP産生の誘導のために
アクシオスコップ2蛍光顕微鏡	ツァイス	452310	セルの可視化
eYFPフィルターセット	クロマ技術	41028	YFPの可視化
CCDカメラ	浜松	オルカAG	セルの可視化
メタモーフソフトウェア(分子デバイス)	SDRサイエンティフィック	31282	本原稿の作成に使用されたバージョン7.8.0.0