細菌遺伝子検出のためのループ媒介等温増幅

要約

出典: Domesle, K. J. ほか。ループ媒介の等温増幅による動物性食品中の サルモネラ のスクリーニングおよび培養分離による サルモネラ の確認。 J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオでは、一定温度でDNAを増幅することで標的細菌遺伝子を検出するためのループ媒介等温増幅(LAMP)技術を実演しています。反応混合物は、等温マスターミックス、標的遺伝子の特異プライマー、DNAテンプレートを含むサンプルを加えて調製されます。増幅はLAMP装置で開始され、標的遺伝子の存在を確認するためにリアルタイム蛍光が監視されます。

プロトコル

注:ループ媒介の等温増幅(LAMP)反応混合物には、DNAポリメラーゼ、バッファー、硫酸マグネシウム(MgSO₄)、デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTPs)、プライマー、DNAテンプレート、水が含まれています。最初の4つの試薬は等温マスターミックスに含まれています(材料表)。プライマーは社内でプリミックスされ、プライマーミックス(10倍)になります。DNAテンプレートは、スクリーニング目的で動物用食品サンプルの濃縮ブロスから、または確認目的で推定 されるサルモネラ 分離株の培養から作成することができます。さらに、すべてのLAMPランに陽性対照(サルモネ ラ の参照株から抽出したDNA、例: Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2])および無テンプレート対照(NTC;滅菌分子グレード水)も各LAMP試験に含まれています。

1. DNAテンプレートの調製

1. 動物の食品強化からDNAテンプレートを作成するには、以下の手順に従ってください。
   1. 動物性食品サンプル25g(例:ドライキャットフード、ドライドッグフード、牛飼料、馬飼料、家禽飼料、豚飼料)を無菌フィルターバッグ(材料表)または同等品に無菌で計量します。孵化中のサポートとして、袋を大きな容器やラックに入れてください。
   2. 滅菌緩衝ペプトン水(BPW)を225mL加えます。手を回して軽くマッサージしてよく混ぜましょう。室温で60分から5分±置いてください。
   3. よく混ぜて、テスト用紙でpHを測ります。必要に応じてpHを6.8±0.2に調整し、無菌1N水酸化ナトリウム(NaOH)または1N塩酸(HCl)を用います。35±2°Cで24時間±2時間孵化します。
   4. 動物性食品の濃縮スープを入れた袋をくるくる回してよく混ぜます。バッグのろ過面からマイクロ遠心分離機チューブに1mLを移します。ボルテックス、短時間。
   5. 以下のようにサンプル調製試薬(材料表)を用いてDNAを抽出します。
      1. 900 x g で1分間遠心分離機で大きな粒子を除去し、上清液を新しいマイクロ遠心分離機チューブに移します。
      2. 16,000 x g で遠心分離機で2分間行い、その後上清液を捨てます。
      3. ペレットを100μLの試料試薬に懸浮させ、100±1°Cで10分間乾燥加熱ブロックで加熱します。
      4. サンプルDNA抽出物を室温まで冷やし、-20°Cで保存します。
2. 推定される サルモネラ 菌培養からDNAテンプレートを作成するには、以下の手順に従ってください。
   1. FDAのBAM第5章「サルモネラセクションD:サルモネラ分離」に従い、すべての食品で培養分離から推定されるサルモネラ分離株を取得してください。
   2. 推定サ ルモネラ 菌を非選択的寒天プレート(例:血寒天、栄養寒天、トリプチカーゼ大豆寒天)に接種し、35±2°Cで24±2時間培養します。
   3. 複数の単一コロニーを5mLのトリプチカーゼ大豆ブロス(TSB)または脳心臓注入(BHI)ブロスに移し、35 ± 2 °Cで16±2時間培養します。
      注意:推定される サルモネラ 菌培養が純粋であれば、このステップは任意で行うことができます。その場合、複数の単一コロニーを5 mLのTSBに懸浮させ、500 μLの懸濁液を100 ± 1°Cで10分間乾燥加熱ブロックで加熱することでDNAテンプレートを準備できます。以下のステップ5を進めてください。
   4. 1晩培養液500μLをマイクロ遠心分離機チューブに移し、100±1°Cで10分間乾燥加熱ブロックで加熱します。
   5. 室温まで冷やし、分離したDNA抽出物を-20°Cで保存します。
3. 陽性対照DNAを準備するには、推定される サルモネラ 菌培養からのDNAテンプレートを1段階希釈で作成する場合も同様の手順を踏みます。
   1. S . Typhimurium ATCC 19585(LT2)または 任意のサルモネラ 系菌株を非選択的寒天プレート(例:血寒天、栄養寒天、トリプチカルド大豆寒天)に接種し、35 ± 2°Cで24±2時間培養します。
   2. 複数の単一コロニーをTSBまたはBHIブロス5mLに移し、35 ± 2 °Cで16±2時間培養し、~10⁹ CFU/mLに到達させます。
   3. 0.1%ペプトン水で一晩ずつ培養液を希釈し、~10⁷ CFU/mLを得ます。
   4. この希釈液500μLをマイクロ遠心分離機のチューブに移し、100±1°Cで10分間乾燥加熱ブロックで加熱します。
   5. 室温まで冷やし、陽性コントロールDNAを-20°Cで保存します。

2. プライマー混合物の調製(10倍)

1. 標準的な脱塩精製(表1)とともに市販のLAMPプライマー(Sal4-F3、Sal4-B3、Sal4-FIP、Sal4-BIP、Sal4-LF、Sal4-LB)を取得します。 各プライマー(100μM)のストック溶液を適切な量の滅菌分子級水で再水和して準備します。10秒ほど渦を巻いてよく混ぜ、-20°C(長期保存は-80°C)で保存します。
2. プライマー混合物(10×)をワークシートに従って準備します(表2)。適切な量のプライマーストック溶液と滅菌分子級の水をマイクロ遠心分離機のチューブに入れます。すべての試薬を10秒の渦巻きでよく混ぜます。10倍プライマー混合物をマイクロ遠心管あたり500μLに分割し、-20°Cで保存します。

3. LAMP反応の組み立て

注意:交差汚染を防ぐために、LAMPマスターミックスの準備とDNAテンプレートの追加に使う部分を物理的に分離することが強く推奨されます。 図1 はLAMP図です。

1. 準備とランの準備
   1. イソプロパノールとDNAおよびDNase分解液でベンチを清掃します(材料表参照)。ピペットとチューブストリップホルダー(材料表)をDNAおよびDNase分解液で洗浄してください。
   2. 等温マスターミックス、プライマーミックス(10倍)、分子級水、陽性コントロールDNA、DNAテンプレートを室温で解凍します。
   3. LAMP計器(材料表)をオンにし、開口画面をタップするとホーム画面にアクセスできます。以下の手順に従ってランを作成します。
      注:LAMP機器のモデルの一つは2つのブロック(AとB)で、それぞれ8つのサンプルが入っています。別のモデルは8つのサンプルを収容できる単一のブロックです(材料表)。
      1. LAMP+Annealをタップし、サンプル情報を入力して編集を選択してください。
         注:デフォルトのLAMPランプロファイルは、65°Cで30分間増幅し、98°Cから80°Cまでのアニール相で、1秒あたり0.05°Cの減少です。
      2. 各サンプル行をタップするとカーソルを起動し、 ABブロック アイコンを使って2つのLAMPインストゥルメントブロックを切り替えて関連するサンプル情報を入力します。
      3. すべてのサンプル情報を入力したら チェック アイコンをタップしてください。
         注意:オプションで、ランセットアップ(「プロファイル」と呼ばれる、デフォルトのLAMPランプロファイルとともにサンプル情報を含む)を後で使用するために保存することができます。 保存 アイコンをタップして、プロフィールにユニークな名前を付けます。次回同じサンプルセットをテストする際には、保存したプロファイルを使って新しいランを開始できます。ホーム画面左下の フォルダ アイコンをタップし、「 プロファイル 」を選択して保存したプロファイルを読み込みます。
2. LAMP反応アセンブリ
   注意:両方のLAMP楽器ブロック(AとB、合計16サンプル)を使用する場合、LAMPマスターミックスを18サンプル分準備してください。LAMPインストゥルメントブロックが1つ(合計8サンプル)だけの場合、LAMPマスターミックスを10サンプル分に準備してください。他のサンプル数については、ピペッティング損失を考慮して体積を調整してください。すべてのLAMP検査には必ず陽性コントロールとNTCを入れてください。各サンプルの独立したLAMPランでの重複検査が推奨されます。
   1. ワークシートに従ってLAMPマスターミックスを準備します(表3)。等温マスターミックス、プライマーミックス、分子級水をマイクロ遠心分離機のチューブに適量に加え、短時間の遠心分離機で優しく渦を巻きます。
   2. チューブストリップをストリップホルダーに入れ、各ウェルに23μLのLAMPマスターミックスを分配します。
   3. すべてのDNAテンプレートを旋渦にかけて、短時間遠心分離機を使います。適切な井戸に2μLのDNAテンプレートを加え、しっかりと蓋を閉めます。
   4. チューブストリップをホルダーから外し、手首をひねって試薬がチューブの底に溜まっているか確認してください。
   5. チューブストリップをLAMP計器ブロックに積み込み、キャップがしっかり固定されているか確認してから蓋を閉めます。

4. ランプラン

注:LAMPランでは、FAMチャネルを使って蛍光の読み取りが取得されます。ピークまでの時間値(Tmax; min)は、蛍光比が増幅率曲線の最大値に達する時点で機器によって自動的に決定されます。 Tm (°C)は最終増幅製品の融解・アニーリング温度です。

1. 画面右上の 「走る 」アイコンをクリックし、チューブストリップを含むブロックを選択してLAMPランを始めてください。
2. オプションとして、反応中は 温度、 増幅、 アニール のタブをタップして、LAMP実行中の様々なパラメータの動的変化を確認できます。
3. 実行完了後、 増幅 と アニール のタブをタップすると完全な増幅曲線とアニール曲線が見られ、結果を表示できる結果 タブをタップ してください。
4. 記録保存のために、画面左上にあるラン番号を「計器シリアルnumber_run番号」の形式(例:「GEN2-2209_0030)」として記録することもできます。

表1:動物性食品中のサルモネラスクリーニングおよび培養分離によるサルモネラ確認のためのLAMPプライマー 。プライマーはサルモネラinvA配列(GenBank登録番号M90846)に基づいて設計されています。

プライマーネーム	形容	シーケンス(5フィート-3フィート)	長さ(bp)
サル4-F3	前方外側プライマー	GAACGTGTCGGGGGAAGTC	18
Sal4-B3	逆向き外プライマー	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	前方内側プライマー	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCCGG	38
Sal4-BIP	逆向き内プライマー	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	ループフォワードプライマー	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	ループ後方プライマー	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

表2:LAMPプライマーミックスの準備ワークシート(10倍)。プライマーは表1に記載されています。

コンポーネント	ストックコンク(μM)	プライマー混合物コンク(μM)	体積(μL)
Sal4-F3プライマー	100	1	10
Sal4-B3プライマー	100	1	10
Sal4-FIPプライマー	100	18	180
Sal4-BIPプライマー	100	18	180
Sal4-LFプライマー	100	10	100
Sal4-LBプライマー	100	10	100
分子級水	該当なし	該当なし	420
トータル	該当なし	該当なし	1000

表3:LAMP反応混合物の調製ワークシート。プライマー混合物(10x)は表2に従って、表1に記載されたプライマーのストック溶液を用いて調製されます。

コンポーネント	作業中。	最終反応、	サンプルあたりの体積(μL)	18サンプル(μL)の体積	10サンプル(μL)の体積
ISO-001 等温マスターミックス	1.67倍	1回	15	270	150
プライマーミックス	10倍	1回	2.5	45	25
分子級水	該当なし	該当なし	5.5	99	55
マスターミックス小計	該当なし	該当なし	23	414	230
DNAテンプレート	該当なし	該当なし	2	該当なし	該当なし

結果

図1:サルモネラLAMPワークフローの概説図。

材料