蛍光生体分子を細菌細胞に送達する電気孔による投与

要約

出典: Aigrain, L. ほか。 エレクトロポレーションによる生体微生物における蛍光生体分子の内部化および観察。 J. Vis. Exp. (2015年)

このビデオでは、電気穿孔を用いて蛍光生体分子を電気適格な微生物細胞に届ける方法を実演しています。このプロセスは、蛍光色素タグ付きDNAやタンパク質を冷却した細胞懸濁液に導入することから始まります。その後、高電圧パルスを施して一時的な膜孔を作り出し、生体分子が細胞質に侵入できるようにします。回復後、細胞は洗浄とろ過を受け、内部化していない、または表面に結合した分子を除去します。最後に、標識された細胞を蛍光イメージングのために装着し、細胞内成分を可視化します。

プロトコル

1. 電気穿孔

1. 潜伏
   1. 低塩バッファー(< 50 mM塩)に保存した標識分子を最大5μlに加え、1つのアリコート(20μl細菌または50μl酵母)を加え、氷で10分間培養します。
      手記： ストック溶液中の蛍光標識分子の濃度、すなわち電気穿孔前に細胞に加えられた標識分子の量は、負荷効率と直接相関しています(図1 および議論参照)。一部のタンパク質は低塩条件に適合しにくいため、貯蔵バッファー内の塩濃度は増加することがありますが、電気穿孔前に細胞に加えられた標識分子の体積を減らす必要があります。
   2. 細胞と標識された生体分子の混合物を、事前に冷却された電気穿孔キュベット(細菌と酵母はそれぞれ0.1cmと0.2cm間隔)に移します。キューベットをベンチに優しく叩いて、溶液から泡が出る可能性を取り除く。
   3. キュベットを電気孔槽に入れ、高電圧の電気パルス(0.9〜1.8 kV/cm、電圧選択の詳細は「議論」参照)を溶液に加えます。このようなパルスは細胞膜に一時的な孔を形成し、標識された生体分子が細胞内に拡散できるようにします。
   4. 電気孔孔器に表示される時間定数が4〜6msの間であることを確認してください。時間定数が低いのは塩分濃度が高すぎたり、キュベット内の気泡の存在が原因で、セルの負荷が非常に低いか全くありません。
2. 回復
   1. 電気穿孔直後、細胞に500μlのリッチ培地(例えば、カタボライト抑制を含むスーパーオプティムブロス)、EZリッチ定義培地、酵母抽出物ペプトンデキストロース(YPD)、またはその他のリッチ培地を加えます。
   2. 細菌用は37°C、酵母用は29°Cで2〜10分培養します。生存可能性測定では、電気穿孔後に細胞の成長・分裂率を評価したい場合、最初の細胞分裂前の遅延時間を観察するため、最大1時間の回復時間を比較します。
3. 洗浄手順
   1. 細胞を洗浄し、体内化していない生体分子を除去するために、細胞を3300 x g、4°Cで1分間スピンダウンして除去します。上清液は捨て、細胞を500μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸浮させます。
      手記： 各サンプルに対して、同じ量の標識生体分子で培養した細胞のネガティブコントロールを準備し、主サンプルと全く同じ方法で電気孔孔化・洗浄していない細胞を準備します。
   2. 前の手順を3回繰り返します。
   3. タンパク質内部化の場合、対象の標識タンパク質の特性や挙動に応じて洗浄手順を最適化します。以下のステップは、可能な最適化の例です。
      1. 最初の3回の洗浄サイクルは、100 mM NaClと0.005%トリトンX-100を含むPBSを用いて、外膜に付着する可能性のある非内部化タンパク質を除去します。
         1. 電気孔抽出セルを1.5mlのマイクロ遠心分離機管内に装着し、0.22μmの孔径フィルターでフィルター内にピペットで送り込みます。800 x g、4°Cで3分間回転させ、流れを捨てます。細胞に500μlの新しいPBSを加え、前回と同じように再度回転させ、この手順を一度繰り返します。
      2. 最初の洗浄サイクルで少量のプロテアーゼK(500μlのPBSで10ng)を加え、体内化されていないタンパク質の消化を促します。
   4. 細胞を3300 x g、4°Cで1分間回転させ、上澄液を捨て、細胞を150μlのPBSに再懸浮させます。
   5. 上部カバースリップを除去し、細胞懸濁液10μlを一滴ずつ広げてアガロースパッドに広げます。パッドの上部に未使用のきれいで焼け焦げたカバースリップ(厚さ1.5枚、顕微鏡対物仕様に合致)を交換し、スライドを非常に優しく押します。
   6. 異なるサンプルを撮影する際、パッドを不透明な箱に入れて光から保護します。

結果

図1:光漂白解析を用いた内部化分子の数のカウント。(A) 単細胞光漂白解析。蛍光強度タイムトレースの例(青:生データ;赤:適合;図:漂白前後にATTO647N標識dsDNAを装填した大腸菌のWLおよび蛍光画像)。トップ:一段階の漂白イベント。中央:±分子を含む細胞で漂白とまばたきが見られます。下:少なくとも10分子に対応する>10ステップを含む細胞。(B) 6段階未満の識別可能なステップを含む...

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