ミ クソコッカス・ザンサス サンプルの生細胞イメージング準備

要約

出典: Schumacher, D. ほか。成長遅い社会細菌 ミクソコッカス・ザンサスの 完全な栄養細胞サイクルの蛍光生細胞イメージング。ジャーナル・ヴィジョンズ報告(2018年)

このビデオでは、成長の遅い土壌細菌である ミクソコッカス・ザンサスの 調製と画像化の方法を実演しています。培養液は培地で培養され、蛍光マイクロスフィアでカバースリップに塗布され、その上に温められたアガロースパッドを重ねて水分補給と栄養供給を支えます。この構成により、細菌細胞分裂中の細胞プロセスの長期タイムラプスライブイメージングが可能になります。

プロトコル

1. 顕微鏡試料の調製

手記： 顕微鏡で観察する細胞は顕微鏡のカバースリップに置かれ、その後アガロースパッドで栄養分を供給します。カバースリップはプラスチックや金属のフレームに接着され、機械的な支持を提供します。顕微鏡検査の準備として、ステップ 2.1から2.3に記載されたように、1%アガロース/TPM/0.2%CTTの大型パッドを事前に準備する必要があります。ここで使用されている特定の製品については、 材料表 もご参照ください。

1. 500 mLのTPMバッファー(10 mM Tris-HCl pH 7.6、1 mM KH₂PO₄ pH 7.6、8 mM MgSO₄)を準備し、ボトルトップフィルターを使ってオートクレーブまたはろ過で滅菌します。

手記： 滅菌バッファーは室温で数ヶ月間保存可能です。

2. 0.2%CTTを含む1%アガロース顕微鏡溶液を準備します(アガロース1gと80 mLのTPMバッファーおよび20 mLの1% CTT培地を混合)。電子レンジでアガロースが溶けるまで加熱します。

手記： 0.2%のCTTは細胞の成長を許し、飢餓を防ぐのに十分です。顕微鏡培地中のCTT濃度が高いと、背景蛍光が高くなります。

3. 溶融アガロースを厚さ0.5cmまでペトリ皿に詰めます(11.5cm×11.5cmの正方形ペトリ皿には約60mLの溶融アガロースが必要です)そして室温まで冷ます。

手記： アガロースパッドは湿度の高い環境で4°Cで最大2日間保存可能です。

1. 使用前に1%アガロース/TPM/0.2%CTTパッドを32°Cで少なくとも15分間予温。

手記： 顕微鏡検査のために細胞を準備するには、 手順2.4から2.8に従ってください。

4. 滅菌ガラスカバースリップ(60 mm x 22 mm、厚さ:0.7 mm)を中央に穴の開いたプラスチックまたは金属フレームに置きます(図1A参照);このフレームは薄いカバースリップの機械的支持として機能し、顕微鏡観察中のドリフトを減らすのに役立ちます。カバースリップをテープでフレームに固定します。

1. フレームを準備するには、厚さ1mmの金属板から75mm×25mmのフレームを切り出し、中央に適切な大きさの穴(この実験では20mm×30mm)を開けます。

5. カバースリップに指数関数的に増殖した M. xanthus 細胞を10〜20μL追加します。

6. 細胞にフィデューシャルマーカーとして蛍光の0.5μm微球を追加し、タイムラプス記録における細胞やタンパク質の追跡を簡素化する。

1. 微小球をTPMバッファーで1:100希釈し、4°Cで最大数ヶ月保存します。使用前によく振ってから、希釈した微小球を5〜10μL加えてください。

手記： ここでは、すべての共通の青、緑、黄、赤蛍光チャネルで蛍光を発するマイクロスフィアが使用されました。

7. 大きな予温された1%アガロース/TPM/0.2% CTTパッドのカバースリップほどの大きさの小さなパッドを切り取り、セルの上に置きます(図1B)。蒸発を防ぎ、細胞を湿った環境に保つために、1%アガロース/TPM/0.2%のアガロースパッドの上にカバースリップを敷きます。

手記： カバースリップだけで少なくとも2時間は大きな蒸発を防ぎます。より長いタイムラプス記録の場合、1%アガロース/TPM/0.2%CTTパッドとカバースリップサンドイッチは蒸発を防ぐためにパラフィンフィルムで密封する必要があります。

8. 顕微鏡サンプルを32°Cで15〜20分間培養し、細胞がアガロースパッドの底に付着するのを待つ。それからタイムラプス顕微鏡の記録を始めてください。

結果

図1:本研究全体で使用された実験装置の概説。 (A) 金属またはプラスチックのフレームが試料の支えとして機能します。カバースリップは金属フレームにテープで固定され、試料の動きを抑えられます。(B)実験サンプルセットアップの側面図。セルは(A)に示されたカバースリップに取り付けられます。細胞に栄養と湿度を供給するアガロースパッドが細胞の上に置かれます。アガロースパッドは蒸発を減ら...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AFCでのDMI6000B	ライカマイクロシステム	11888945	自動逆位置広視野蛍光顕微鏡(適応フォーカス制御付き)
ユニバーサルマウントフレーム	ライカマイクロシステム	11532338	異なるサンプルサイズのステージホルダー
HCX PL フルオター 100X/1.30 オイル PH3	ライカマイクロシステム	11506197	位相差対物レンズ
オルカフラッシュ4.0カメラ	浜松	11532952	4.0メガピクセルのsCMOSカメラによる画像取得
フィルターセット TXR ET, k	ライカマイクロシステム	11504170	蛍光フィルターセット、例:560/40 Em:645/75
フィルターセット L5 ET, k	ライカマイクロシステム	11504166	蛍光フィルターセット、例:480/40 Em:527/30
フィルターセット YFP ET, k	ライカマイクロシステム	11504165	蛍光フィルターセット、例:500/20 電磁部:535/30
プロスキャンIII	事前	H117N1、V31XYZEF、PS3J100	インタラクティブコントロールセンターを備えた顕微鏡オートメーションコントローラ
EL 6000 光源	ライカマイクロシステム	11504115	外部蛍光光源
インキュベーターBLXブラック	ペコン	11532830	顕微鏡を囲む黒い培養室
Tempcontrol 37-2 デジタル	ライカマイクロシステム	11521719	インキュベーションチャンバーの自動温度制御
ゲントマイシン硫酸塩	カール・ロス	233.4	ゲンタマイシン
オキシテトラシリン二水和物	シグマ・オルドリッチ	201-212-8	オキシテトラサイクリン
カナマイシン硫酸塩	カール・ロス	T832.3	カナマイシン
Filtropur BT25 0.2ボトルトップフィルター	サーステット	831,822,101	バッファーの滅菌用ボトルトップフィルター
デックグレーザー	VWR	630-1592	ガラスカバースリップ(60 x 22 mm、厚さ:0.7 mm)
Seakem LE アガロース	ロンザ	50004	顕微鏡スライド用のアガロース
ライカ メタモーフ AF	ライカマイクロシステム	11640901	顕微鏡制御ソフトウェアおよび画像解析用ソフトウェア
テトラスペック・マイクロスペア、0.5 μm	サーモフィッシャー	T7281	蛍光微小球
ペトリ皿	グライナー・バイオワン	688102	アガロースパッド用120mm x 120mm x 17 mmの正方形ペトリ皿
BDバクト・カシトーネ	ベクトン・ディキンソン	225930	カシトーネ
パラフィルムM	VWR	291-1213	パラフィルム
トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン	カール・ロス	AE15.2	トリス
硫酸マグネシウム七水和物	カール・ロス	P027.2	硫酸マグネシウム
カリウム二水素リン酸 p.a.	カール・ロス	3904.1	リン酸二水素カリウム
1%CTT培地:1%(w/v)BDバクト™カシトン、10 mM トリスHCl、pH 8.0、1 mM リン酸カリウムバッファーpH 7.6、8 mM MgSO₄			M.xanthusの栽培培地
TPMバッファー:10 mM トリスHClのpH 8.0、1 mM リン酸カリウムバッファー pH 7.6、8 mM MgSO₄			M.xanthusの顕微鏡スライド準備用バッファー