モデルタンパク質の熱展開による細菌シャペロン活性の評価

要約

出典: Dahl, J. ほか。 大 腸菌 シャペロンHdeBのpH依存活性の検出 in vitro および in vivo。 J. Vis. Exp. (2016年)

このビデオでは、酸ストレス下で基質タンパク質のシャペロン活性を評価する蛍光分光光度計を用いたアッセイを実演します。基質の展開と光散乱による凝集の監視手順、付き添いの有無の条件の比較について説明しています。

プロトコル

1. 熱展開マレート脱水素酵素(MDH)を用いたシャペロン活性アッセイ

手記： 精製されたHdeBが、異なるpH値で熱展開する豚のミトコンドリアマレート脱水素酵素(MDH)の凝集に与える影響を以下に追跡しました。記載されているすべてのタンパク質濃度はモノマー濃度を指します。

1. MDHを製製するには、MDHを4°Cで4LバッファーC(50 mMリン酸カリ、50 mM塩化ナトリウム(NaCl)、pH 7.5)に対して一晩透析し、分子量カットオフ30 kDaの遠心フィルターユニットで約100 μMまで濃縮します。
   手記： MDHは硫酸アンモニウム溶液として投与されるため、慎重な透析が必要です。
2. 凝集体を除去するには、タンパク質を20分間、20,000 x g、4°Cで遠心分離します。MDH濃度は280 nm(ε_{280 nm}=7,950 ^{M-1 cm-1})で吸収によって決定します。50μlのMDHアリコートを準備し、そのアリコートを急凍して保管します。
3. 1mlのクォーツクヴェットを、温度制御されたサンプルホルダーと攪拌器を備えた蛍光分光光度計に入れます。λ_ex/em を350 nmに設定してください。
4. 所定のpH値(pH:pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 4.0、pH 5.0)で予備加熱(43°C)バッファーD(150 mMリン酸カリウム、150 mM NaCl)を適切な量でキュベットに加え、キューベットホルダー内の温度を43°Cに設定します。総体積は1,000μlです。
5. バッファに12.5μM HdeB(またはバッファ制御用に同体積のHdeBストレージバッファ)を加え、さらに0.5μM MDHを追加します。光の散乱を監視し始めてください。反応を360秒間キュベートし、MDHの十分な展開を促します。
6. 2 MのバッファーなしK₂HPO₄ を0.16〜0.34の体積に加え、さらに440秒間光散乱を記録し続けてpHを7に上げます。
7. 中和後(以下、MDHの最大光散乱が観測された500秒後)に、シャペロン不在時に記録されるMDH凝集の程度を100%に設定します。HdeBの活性を、各示されたpH値でHdeBが存在しない場合のMDHの光散乱信号に正規化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マレート脱水素酵素(MDH)	ロシュ	10127914001
リン酸カリウム(モノベーシ)	フィッシャー・サイエンティフィック	BP362-500
リン酸カリウム(ジベーシウム)	フィッシャー・サイエンティフィック	BP363-1
F-4500蛍光分光光度計	日立	FL25
蛍光細胞キュベット	ヘルマ・アナリティクス	119004F-10-40
塩酸	フィッシャー・サイエンティフィック	A144-212
水酸化ナトリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	BP359-500
アミコン ウルトラ遠心フィルターユニット 30K	ミリポール	UFC803024
塩化ナトリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	S271-10
Spectra/Por 1透析膜MWCO:6 kDa	スペクトラム研究所	132650
ヴァリアン・ケアリー50分光光度計	アジレント・テック