出典:Dahl, J.ら。大腸菌シャペロンHdeBのpH依存活性の検出 in vitroおよびin vivo。J. Vis. Exp.(2016年)
このビデオは、組換え大 腸菌 培養を用いて酸性活性化シャペロンの保護効果を評価する方法を示しています。細菌増殖モニタリングにより、シャペロン発現培養菌で対照群と比べて生存率が向上し、ストレス条件下でのタンパク質安定化におけるシャペロンの役割が浮き彫りになりました。
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方法論記事
酸ストレス下の 大腸菌 における酸活性化シャペロンの保護的役割の評価
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2025年11月28日
この記事について
要約
プロトコル
1. 酸ストレス下での大腸菌生存に対するシャペロンHdeB過剰発現の影響
注:大 腸菌 MG1655ゲノムDNAは標準プロトコルを用いて単離されました。
- 大腸菌MG1655からシャペロンのhdeBを、プライマーhdeB-BamH、I-rev、GGT、GGT、CTG、TCC、TTTA、ATT、CGG、CAA、GTC、ATT、ATT、そしてhdeB-EcoR、I-fw、GGT、GCC、GAA、TTC、AGG、CGC、AT、AAT、TCA TCT CTC、C、Cを使い、PCRで増幅します。
- PCR反応を50μlで以下のようにセットアップします:10μl 5xポリメラーゼバッファー、200μM dNTPs、0.5μMプライマーJUD2、0.5μMプライマーJUD5、ゲノムDNA MG165515 ng、0.5 μl DNAポリメラーゼ、ddH2Oを50 μlに加えます。
- hdeBの増幅は以下の通りです:ステップ1:95°Cで5分、1サイクル;ステップ2:95°Cで30秒、55°Cで30秒、72°Cで30秒、40サイクル;ステップ3:72°Cで10分間。
- 制限部位クローニングの標準手法を用いて、プラスミドpBAD18の EcoRIおよび BamHI部位にPCR断片をクローニングしました。メーカーの説明書に従ってプラスミド精製キットを使ってプラスミドを精製してください。シーケンスで得られたプラスミドを検証してください。
- HdeBまたは空ベクター制御剤pBAD18を、株BB7224(ΔrpoH)(遺伝子型:F-, λ-, e14-、[araD139]B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(SmR) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn 10(TcS) suhX401 deoC1 araD+ rpoH::kan+)を化学的に適格な細胞で使用しました。
手記： この品種は温度に敏感です。 - 42°Cで45秒の熱ショックを受けた後、メッキ前に30°C、200rpmで細胞を培養します。陽性クローンの単一コロニーストリークアウトを行い、30°Cで一晩培養します。50mlのLBアンペア で一晩培養し、細胞を200rpm、30°Cで培養します。
- 25mlLBアンペア に40倍の培養液を希釈し、0.5%アラビノース(Ara)を30°C、200rpmで培養し、O.D.600nm =1.0でHdeBタンパク質発現を誘導します。
- pHシフト実験では、LBAmp+Ara を使って細胞をO.D.600nm の0.5に希釈し、それぞれのpH値(ここではpH 2.0、pH 3.0、pH 4.0)に合わせて適切な5 M HClの体積を加えて調整します。
- 指定された時間点(pH2、1分、pH3、2.5分、pH4、30分)後に、適切な5 M NaOHの体積を加えて培養物を中和します。
- 中和培養液の成長を30°Cで12時間、O.D.測定を用いてモニタリングします。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| NEB10-β大 腸菌 細胞 | ニューイングランド・バイオラボ | C3019I | |
| アンピシリン | ゴールド・バイオテクノロジー | A-301-3 | |
| LBブロスミックス、レノックス | LABエクスプレス | 3003 | |
| F-4500蛍光分光光度計 | 日立 | FL25 | |
| ウィザードプラスミニプレップキット | プロメガ | A1470 | プラスミド精製に使用 |
| L-アラビノース | ゴールド・バイオテクノロジー | A-300-500 | |
| 蛍光細胞キュベット | ヘルマ・アナリティクス | 119004F-10-40 | |
| オリゴヌクレオチド | インビトロジェン | ||
| フュージョン高忠実度DNAポリメラーゼ | ニューイングランド・バイオラボ | M0530S | |
| dNTP集合 | インビトロジェン | 10297018 | |
| 塩酸 | フィッシャー・サイエンティフィック | A144-212 | |
| 水酸化ナトリウム | フィッシャー・サイエンティフィック | BP359-500 | |
| Veriti 96井戸サーマルサイクラー | サーモ・フィッシャー | 4375786 |
