このビデオは、魚の病原性細菌由来の蛍光標識可変数タンデムリピート(VNTR)増幅を毛細管電気泳動を用いて分離し、細菌同定のためのサイズ特異的エレクトロフェログラピープロファイルを生成する手順を示しています。
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方法論記事
可変数タンデムリピート(VNTR)解析による魚類病原体の検出
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2025年11月28日
この記事について
要約
プロトコル
1. 毛細管電気泳動のセットアップと実行条件
- PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)アンプリコンの確認後、精製水で1:10(v/v)で薄めたPCR産物を投与します。密封し、混ぜて、短時間遠心分離機で行います。
- 煙幕キャビネットで作業し、PCR製品あたり9μLのホルマミドと0.5μLの標準サイズからなるマスターミックスの体積を準備します(余剰体積は10%を許容)。一時的にボルテックスし、利用可能なCE(毛細管電気泳動)システムに適したプレート上のウェルに9.5μLを分散させ、その後0.5μLの希釈PCR産物を加えます。密封し、混ぜて、短時間遠心分離機で行います。
注意： 慎重に扱ってください。ホルムアミドを水に混ぜると、有毒な蟻酸が生成されます。 - PCRサーマルサイクラーを用いて、試料を95°Cで3分間変性させ、その後4°Cまで無期限に冷却します。短時間遠心分離機を使い、メーカーの指示に従って校正済みのCEシステムにプレートを載せます。
- 選定装置および以下の設定に応じて試薬を用いて断片分析(CE)を実施します:60°C;1.6 kV(32 V/cm)での5秒注入;15 kV(300 V/cm)で32分の運転時間。24キャピラリー(50cm)上の24井戸のCE破片解析は通常約50分かかります。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Avant 3500xL 遺伝子解析装置 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | A30469 | 毛細血管電気泳動断片解析に使用されます。 |
| BioNumerics7モジュール | 応用数学 | NA | MLVAデータから最小スパニング木を生成するために使用されます。 |
| 遠心分離機 | 望む通りです。 | NA | |
| エッペンドルフ・セーフロックチューブ、1.5 mL | エッペンドルフ | 30120086 | DNA抽出時に使われる遠心分離機チューブ。 |
| フリーザー | 望む通りです。 | NA | |
| フューム・キャプテン | 望む通りです。 | NA | |
| GeneMapper ソフトウェア 5 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 4475073 | 毛細管電気泳動による電気ペログラムの読み取りに使用されます。 |
| GeneScan 600 LIZ染料サイズ標準 v2.0 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 4408399 | 毛細血管電気泳動中に使用されるサイズ標準。 |
| ハイディ・ホルマミド | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 4311320/4440753 | 毛細管電気泳動中に使用された脱イオン化ホルムアミド。作業用のアリクウトを用意しろ。 |
| ミリQ水 | NA | NA | PCRおよび毛細管電気泳動の際に使用される精製水。標準的なレシピ;社内で制作されました。 |
| マルチプレックスPCRプラスキット | キアゲン | 206151/206152 | |
| PCRサーマルサイクラー | 望む通りです。 | NA | |
| 3500 DX/3500xL DX遺伝子分析装置用のPOP-7ポリマー | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | A26077/4393713/4393709 | 毛細管電気泳動中に使用される分離マトリックス。 |
| 純粋栽培 イェルシニア・ルッケリ | NA | NA | 例えば、クライオ保存や新鮮なものなどです。 |
| RNaseフリーの水 | キアゲン | NA | 収録:マルチプレックスPCRプラスキット |
| トリスホウ酸塩EDTA(TBE)バッファー | NA | NA | 標準的なレシピ;社内で制作されました。 |
| トリプシン大豆寒天/牛血寒天 | NA | NA | 標準的なレシピ;社内で制作されました。 |
| ボルテクサー | 望む通りです。 | NA |
