可変数タンデムリピート(VNTR)解析による魚類病原体の検出

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Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出典: Gulla, S. ほか。魚類病原性細菌 Yersinia ruckeri の多遺伝子座可変数タンデムリピート解析(多重PCRおよび毛細管電気泳動による解析)。 J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、魚の病原性細菌由来の蛍光標識可変数タンデムリピート(VNTR)増幅を毛細管電気泳動を用いて分離し、細菌同定のためのサイズ特異的エレクトロフェログラピープロファイルを生成する手順を示しています。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 毛細管電気泳動のセットアップと実行条件

PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)アンプリコンの確認後、精製水で1:10(v/v)で薄めたPCR産物を投与します。密封し、混ぜて、短時間遠心分離機で行います。
煙幕キャビネットで作業し、PCR製品あたり9μLのホルマミドと0.5μLの標準サイズからなるマスターミックスの体積を準備します(余剰体積は10%を許容)。一時的にボルテックスし、利用可能なCE(毛細管電気泳動)システムに適したプレート上のウェルに9.5μLを分散させ、その後0.5μLの希釈PCR産物を加えます。密封し、混ぜて、短時間遠心分離機で行います。
注意： 慎重に扱ってください。ホルムアミドを水に混ぜると、有毒な蟻酸が生成されます。
PCRサーマルサイクラーを用いて、試料を95°Cで3分間変性させ、その後4°Cまで無期限に冷却します。短時間遠心分離機を使い、メーカーの指示に従って校正済みのCEシステムにプレートを載せます。
選定装置および以下の設定に応じて試薬を用いて断片分析(CE)を実施します:60°C;1.6 kV(32 V/cm)での5秒注入;15 kV(300 V/cm)で32分の運転時間。24キャピラリー(50cm)上の24井戸のCE破片解析は通常約50分かかります。

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Avant 3500xL 遺伝子解析装置	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A30469	毛細血管電気泳動断片解析に使用されます。
BioNumerics7モジュール	応用数学	NA	MLVAデータから最小スパニング木を生成するために使用されます。
遠心分離機	望む通りです。	NA
エッペンドルフ・セーフロックチューブ、1.5 mL	エッペンドルフ	30120086	DNA抽出時に使われる遠心分離機チューブ。
フリーザー	望む通りです。	NA
フューム・キャプテン	望む通りです。	NA
GeneMapper ソフトウェア 5	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	4475073	毛細管電気泳動による電気ペログラムの読み取りに使用されます。
GeneScan 600 LIZ染料サイズ標準 v2.0	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	4408399	毛細血管電気泳動中に使用されるサイズ標準。
ハイディ・ホルマミド	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	4311320/4440753	毛細管電気泳動中に使用された脱イオン化ホルムアミド。作業用のアリクウトを用意しろ。
ミリQ水	NA	NA	PCRおよび毛細管電気泳動の際に使用される精製水。標準的なレシピ;社内で制作されました。
マルチプレックスPCRプラスキット	キアゲン	206151/206152
PCRサーマルサイクラー	望む通りです。	NA
3500 DX/3500xL DX遺伝子分析装置用のPOP-7ポリマー	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A26077/4393713/4393709	毛細管電気泳動中に使用される分離マトリックス。
純粋栽培イェルシニア・ルッケリ	NA	NA	例えば、クライオ保存や新鮮なものなどです。
RNaseフリーの水	キアゲン	NA	収録:マルチプレックスPCRプラスキット
トリスホウ酸塩EDTA(TBE)バッファー	NA	NA	標準的なレシピ;社内で制作されました。
トリプシン大豆寒天/牛血寒天	NA	NA	標準的なレシピ;社内で制作されました。
ボルテクサー	望む通りです。	NA

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