合成口腔細菌群集を消化の模擬段階に曝露する

この記事について

要約

このビデオは、模擬経口、胃、腸の消化過程における合成口腔微生物群集の生存可能性評価を示しています。細菌の生存率は各段階後に定量化され、消化ストレスによる進行的な減少が明らかになります。

プロトコル

1. in vitro消化管輸送条件後の細菌生存

手記： 以下に記載した改良を加えた模擬消化液を準備します。すべての希釈物を超純水で準備してください。すべての溶液を0.22μmフィルターで滅菌し、無菌条件下で消化処理を行います。

経口消化:
1. 細菌群集3 mLを50 mLの滅菌チューブに入れ、3 mLの模擬唾液液(SSF)と混合します。SSFはミリモール毎リットル(mmol L⁻¹)で含まれます:塩化カリウム(KCl)、15.1;一カリウムリン酸(KH₂PO₄)、3.7;重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)、6.8;塩化マグネシウム六水和物(MgCl₂·6H₂O)0.5、炭酸アンモニウム[(NH₄)₂CO₃]、0.06;塩酸(HCl)1.1;塩化カルシウム二水和物(CaCl₂·2H₂O)、0.75。SSFにヒト唾液(タイプIX-A)から75 U/mLの α-アミラーゼと豚の胃(タイプII)から 2 g/L のムシンを加えます。
2. 混合物を37°C、100rpmで2分間孵化させます。DNA抽出およびフローサイトメトリー定量(S1)のために2mLのサンプルを採取します。

2. 胃消化:

模擬胃液(SGF)4mLを追加し、(mmol L-1)を含む:KCl6.9;KH₂PO₄、0.9;NaHCO₃ 25;塩化ナトリウム(NaCl)47.2;MgCl₂·6H₂O、0.1、(NH₄)₂CO₃、0.5;塩酸15.6;CaCl₂·2H₂O、0.075。さらに、SGFには豚の胃(タイプII)から2g/Lの粘液が含まれていました。
pHを測定し、必要に応じて1モル(1 M)HClでpH3に調整します。37°C、100rpmで孵化します。2mLのサンプル(S2)を採取します。

3. 小腸の消化:

4mLの模擬腸液(SIF)を追加し、(mmol L-1)を含む:KCl、6.8;KH₂PO₄、0.8;NaHCO₃ 85;NaClは38.4;MgCl₂·6H₂O、0.33;塩酸8.4;CaCl₂·2H₂O、0.3、消化管へ。
必要に応じて1M水酸化ナトリウム(NaOH)を用いてpH7に調整してください。37°C、100rpmで孵化します。2 mLのサンプル(S3)を採取します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前	会社	カタログ番号	コメント
豚胃タイプIIからの粘液	シグマ・オルドリッチ	M2378
PBS	ギブコ	14190250
ミリポール・ミリ-Q学術用超純水システム	ミリポーア、メルク KGaA	-
InnOva 4080インキュベーター・シェーカー	ニューブランズウィック・サイエンティフィック	8261-30-1007
ヌクレアーゼフリー水	セルヴァ電気泳動	28539010
BD Accuri C6フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	653118
InnuPREP PCRpure キット	アナリティク・イェナ	845-KS-5010250	PCR精製キット

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