病原性細菌に感染した植物の葉組織からゲノムDNAを抽出する

要約

出典: Gulla, S. ほか。 魚類病原性細菌 Yersinia ruckeri の多遺伝子座可変数タンデムリピート解析(多重PCRおよび毛細管電気泳動による解析)。 J. Vis. Exp. (2019年)。

このプロトコルは、超純水に単離されたコロニーを懸浮させ、熱を加えて細胞を溶解することで Yersinia ruckeri からゲノムDNAを抽出します。遠心分離によりDNA含有上清液を細胞残骸から分離し、PCRベースの遺伝子型解析や疫学解析に適したテンプレートDNAが得られます。

プロトコル

1. 細菌によるゲノムDNAの培養と抽出

1. 適切な寒天タイプ(著者らは5%の牛血寒天を使用)で純種酵母をまき、22°Cで1〜2日間、または15°Cで3〜4日間培養します。
2. 各寒天プレートから、接種ループ付きの代表的なコロニーを選び、50μLの超純化水を含む1.5mL遠心分離機チューブに移します。100°Cの加熱ブロックで7分間抱卵し、短時間渦巻きします。
3. 16,000 x g で3分間遠心分離し、ピペットを使って上清液を空の1.5 mL遠心分離機チューブに慎重に移します。次のステップに進み、上清液をテンプレートDNAとして使用するか、その間-20°Cで保存してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウィザード ゲノミックDNA精製キット	プロメガ	A1120	核溶解、RNase、タンパク質沈殿、DNA再水和溶液の供給源
液体窒素	エアプロダクツ	該当なし
マスターサイクラープロとコントロールパネル付き	エッペンドルフ	6321000019
1250W電子レンジ	パナソニック	該当なし
5424卓上遠心分離機	エッペンドルフ	05-403-93
Isotemp 215デジタル水浴	フィッシャー・サイエンティフィック	15-462-15Q
金属スパチュラ	シグマ・オルドリッチ	Z283274
乳鉢と乳棒	シグマ・オルドリッチ	Z247464
LSEボルテックスミキサー	コーニング	6775
2-プロパノール	シグマ・オルドリッチ	I9516
滅菌10μLチップ	TipOne	1161-3730
滅菌200μLチップ	TipOne	1163-1730
滅菌1250μLチップ	TipOne	1161-1750
可変容量ピペットキット	VWR	75788-460
臭化エチジウム	シグマ・オルドリッチ	E1510
アガロース	IBIサイエンティフィック	IB70041
EDTA	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	17892
酢酸	フィッシャー・ケミカル	A38-212
トリスベース	シグマ・オルドリッチ	10708976001
μキュベット	エッペンドルフ	6138000018
バイオスペクトロメーターの基本	エッペンドルフ	6135000009