プソドモナスシリンガにおけるバクテロオシン媒介殺死検出のためのソフトアガーオーバーレイアッセイ

要約

出典: Hockett, K. L., および Baltrus, D. A. 細菌が産生する阻害性化合物をスクリーニングするためのソフト寒天オーバーレイ技術の利用。 J. Vis. Exp. (2017年)

この動画は、抗生物質誘発ドナー株の上清をテスト株を含む軟寒天のオーバーレイに検出することで、バテリオシン媒介による殺死を検出する方法を示しています。培養後に形成される透明ゾーンは細菌の抑制を示しています。

プロトコル

1. オーバーレイの準備と活性の上清液の検査

1. 感度検査用の P. シリンゲ 株を1コロニー3ml(キングスミディアムB)に接種し、室温で一晩振って培養します。
2. 翌朝、培養液を1/100で新しいKBに薄めます。室温で振って3〜4時間孵育します。
3. 滅菌水寒天は、0.35〜0.7%(w/v)の寒天を超純水にオートクレーブして製製します。
   手記： 軟水寒天のストックはマイクロ波で溶かし、繰り返し再利用できます。各実験ごとに新しいオーバーレイを作成する必要はありません。水寒天を再利用する場合は、電子レンジ加熱後に完全に溶かすことが非常に重要です。そうでなければ、固形時にオーバーレイがざらついた質感になり、解釈が難しくなります。
4. 使用前に、溶けた軟寒を60°Cの水浴で維持してください。滅菌血清学ピペットを用いて、3mlの軟質寒天を無菌培養チューブに移します。溶融状態を維持するために培養チューブを水浴に戻してください。
5. オーバーレイを注ぐには、まず溶けた寒天を冷ませてください(触れると温かく感じるが熱く感じない状態)。ただし固まらないようにしてください。
6. 滅菌フード内で、100μlのテスター株培養を軟寒天に接種し、ボルテックスで混合します。手で培養液を10〜15秒回転させた後、底面の寒天(KB寒天)に注ぎます。プレートをあらゆる方向に傾けて、柔らかい寒天が底の寒天を均等に覆うようにします。
   手記： ボトム寒天は、試験株が活発に成長する固化(1.5%寒天)培地のいずれかです。標準的な直径100mmのペトリ皿には、溶かした培地を約20ml使用してください。底寒天は乾燥せずに4°Cで維持すれば数週間前に準備することも、当日から調理することも可能です。
7. 皿を蓋をして20〜30分固らせます。固まっている間はプレートを乱さないように注意してください。
8. 固化したら、上清液を2〜5μlの上層液を上層に塗ります。プレートは室温で一晩培養します。翌朝に結果を観察し記録してください。
   手記： 上清液を連続的に希釈して検査し、点検することが有用かもしれません。これにより、バクテリオファージとバクテリオシンクリア活性を区別できるようになります。この場合、1:5または1:10の希釈を行うことが推奨されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ミトマイシンC	サンタクルーズ・バイオテクノロジー	SC-3514	発癌性。特にストック溶液を準備する際は、適切なPPE(手袋、目保護具、マスク)を着用してください。
細菌学的グレード寒天	ジェネシー・サイエンティフィック	20-274