単一コロニー選択によるストレス適応細菌の単離

要約

出典: Jeong, H. ほかケモスタットを用いた微生物の適応的実験室進化の手順。 J. Vis. Exp.(2016年)。

この動画は、長期間のストレス環境にさらされた培養から、ストレス適応細菌が選択的に分離され増殖する様子を示しています。培養液はストレッサーを含む寒天の上にプレートされ、単一のコロニーが選定されてストレッサーを液体培地に接種します。吸収は定期的に測定され、増殖を監視し、ストレス適応細菌の分離が成功したことを確認します。

プロトコル

1. 装備の準備

1. 吸気口と出口口が入った化学計器の瓶(150〜250ml)またはエルレンマイヤーフラスコ(250ml)を用意してください。ポートをシリコンチューブで接続し、流量は10〜100ml/hにします。オプションで、エアベント、エアアウトレットポート、温度管理可能な水の入出口ポートを使用することも可能です。
2. 攪拌や温度制御が可能なケモスタットジャーに適した装置を用意するか、回転振動インキュベーターを使用してください。
3. 新鮮培地を送り、培養液を採取するために2台の蠕動ポンプを用意してください。
4. 中型出口ポートとエアインレットポートを備えたリザーバージャー(10〜20L)を用意してください。
5. 希釈速度に適したシリコンチューブ(すなわち、内径0.8mm、流量範囲0.06〜36ml/min;L/S 13チューブ)を使います。

2. 培地調製と滅菌

1. 初期媒体
   1. 90 mLの蒸留水(D.W.)に、0.3 gのグルコース、0.08 g塩化アンモニウム(NH₄Cl)、0.05 g塩化ナトリウム(NaCl)、0.75 gのリン酸水素二水素ナトリウム(Na₂HPO_{4.2H 2}O)、および0.3 gの二リン酸水素ナトリウム(KH₂PO₄)を、ケモスタット瓶に溶けます。
   2. ケモスタットの瓶とチューブをクランプで密封してください。エアベントを密閉しないでください。
   3. ケモスタットのジャーを121°Cのオートクレーブで15分間滅菌します。滅菌後は、ケモスタットの瓶を室温で保管してください。
   4. 硫酸マグネシウム0.02g(MgSO₄·7H_2O)、0.01g塩化カルシウム(_CaCl2)、チアミン0.1mgを10 mL D.W.(溶液A)に溶解します。
   5. シリンジと事前に滅菌されたシリンジフィルター(0.45μm孔隙フィルター)を使用したフィルター溶液A。
   6. 化学計検査器の瓶に溶液Aろ過液を加えます。
2. 応力媒質
   1. グルコース30g、NH_{4 Cl 8}g、NaCl 5 g、75 g Na₂HPO₄·2H₂O、KH₂PO₃₀ g、六水和ジナトリウム200 g(Na₂·スクシネート・6H₂O;この実験で使用)を9.9L D.W.に溶けてリザーバージャーに浸します。
   2. リザーバーの瓶とチューブをクランプで密封してください。エアベントを密閉しないでください。
   3. リザーバージャーを121°Cのオートクレーブで15分間滅菌します。滅菌後は常温で保存してください。
   4. 2 g MgSO₄·7H₂O、1g CaCl₂、10 mgチアミンを100 ml D.W.(溶液A)に溶かします。
   5. フィルター溶液Aにシリンジと事前滅菌済みのシリンジフィルター(0.45μm孔隙フィルター)を組み合わせます。
   6. 溶液Aろ過液をリザーバーの瓶に加えます。
   7. 滅菌したシリコンチューブを無菌的にリザーバージャーに接続し、蠕動ポンプを取り付けます。
3. 高ストレス中層
   1. 2.2節と同様に培地を準備しますが、ストレスの濃度を高くします(すなわち、スクシネート適応量を3〜5 g/L高め)。
      注:このプロトコルは、媒体を通じて伝えられる応力への適応のためのものです。温度、攪乱、照明などの物理的ストレス要因がある場合は、それに応じて栽培を設計すべきです。

3. 初期栽培

1. 野生型大腸菌(E. coli)の単一の菌落を、初期培地4mlを含む15mlの試験管に接種します。
2. 試験管をシェイキングインキュベーターで37°C、220rpmで12時間培養します。
3. 無菌的に1mlの前培養液をケモスタットのジャーに移します。
4. ケモスタットジャーを37°Cで6時間、通気(空気50ml/分)と攪拌(200rpm)を含んで孵化させます。

4. ストレス適応

1. ポンプのシリコンチューブの端を無菌的にケモスタットジャーに接続します。
2. 出口ポンプ(10ml/h以上)を起動し、培養を採取します。注意:培養は指数関数的段階、通常は初期培養後4〜8時間に進むべきです。
3. 出口チューブからの培養液の光学密度(600nm)を確認してください。
4. インレットポンプ(10ml/時間、希釈速度0.1時間〜1分)を起動します。
5. 24時間ごとに出口チューブから600nmの培養物の光学密度をチェックしてください。
6. ケモスタットは96時間(9.6倍の回転)以上運転してください。光学密度が安定していれば、高応力媒体を含むリザーバーを交換します。光学密度が0.2未満の場合は、給餌入口ポンプを6時間停止してください。インレットポンプを再始動し、光学密度が0.2を超えているか確認してください。
7. 徐々に、より高いストレッサー濃度を含む貯蔵槽に切り替えて、ストレッサーの濃度を徐々に上げていきます。
8. 適応培養がマイルストーン(例:100 g/Lのスクシネートストレスに適応した株)に達した際にサンプルを採取し、さらなるゲノム解析のために保存してください。
9. サンプル保存のために、培養サンプル(0.5 ml)を滅菌した80%グリセロール溶液(0.5 ml)と混合し、-80°Cで保存します。注意:微生物がALEプロセス中にストレッサーを分解する能力を獲得した場合、発酵ジャー内のストレッサー濃度は新鮮なリザーバーの濃度とは異なります。

5. ストレス適応株の単一コロニー分離

1. 同じストストレス要因と濃度の培地を含む寒天プレート培地(1.6%寒天)を準備します。
2. ケモスタットから排出培養液(0.1ml)をプレートし、37°Cで16時間培養します。
3. 無菌の爪楊枝でプレートから単一のコロニーを採取し、同じストレッサーと中濃度の15ml試験管に接種し、6時間培養します。
4. 培地ブロス1mlを培地50ml入り250mlのエルレンマイヤーフラスコに移します。1時間ごとに0.5mlの培養液を収穫し、600nmでO.D.を測定します。適応株の成長率と、ストレス要因を考慮した野生株の成長率を比較してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ミニケモスタット発酵機	バイオトロン社	-	特別注文で製造
シリコンチューブ	コール・パーマー	マスターフレックス L/S 13	チューブのサイズは希釈率や発酵瓶の大きさに応じて変えられます。
貯水池の壺	ベルコ	メディア保存ボトル	20L
化学薬品	シグマ・オルドリッチ	-	試薬グレード
グルコース	シグマ・オルドリッチ	G5767	ACS試薬
NH₄Cl	シグマ・オルドリッチ	A9434	分子生物学の場合、細胞培養に適した≥99.5%
NaCl	シグマ・オルドリッチ	746398	ACS試薬、≥99%
Na₂HPO₄·2H₂O	シグマ・オルドリッチ	4272	98.5-101%
KH₂PO₄	シグマ・オルドリッチ	795488	ACS試薬、≥99%
MgSO₄·7H₂O	シグマ・オルドリッチ	230391	ACS試薬、≥98%
CaCl₂	シグマ・オルドリッチ	793639	ACS試薬、≥96%
チアミン・HCl	シグマ・オルドリッチ	T4625	試薬グレード、≥99%
Na₂スクシナート・6H₂O	シグマ・オルドリッチ	S2378	ReagentPlus、≥99%