海洋細菌の汚染分解菌株の分離スクリーニング

要約

出典: Villela, H. D. M. ほか 生物修復のための微生物株の探査およびメタオーガニズム研究・保存のためのプロバイオティクス開発。 J. Vis. Exp. (2019年)。

この動画では、EE2含有培地内での連続希釈、コロニー選択、増殖を通じて汚染物質分解性の海洋細菌を分離する方法を示しています。EE2を唯一の炭素源として用いることで、この環境汚染物質を代謝できる細菌株を特定します。

プロトコル

1. 微生物分離のための水とサンゴの収集と貯蔵

手記： サンプリング地点の座標と温度を把握することが不可欠です。可能であれば、塩分、pH、深さ、光強度などのメタデータも、微調整された栽培方法の発見や将来のデータの解釈に役立ちます。信頼できる結果を得るためには、サンプルを可能な限り最小限の時間保存してください。サンプルが適切な温度で保管されなかったり、長期間保存されると、水やサンゴの微生物叢は大きく変化する可能性があります。分離工程が収集直後に行われない場合、処理までサンプルを4°Cに保つことが重要です。サンプルを4°Cの温度でも長く保管すればするほど、微生物群集の変化は大きくなります。

1. 海水を採取して保存しましょう。
   1. 各ターゲット採取地点から少なくとも3倍の500mLの水サンプルを採取してください。できればスクリューキャップ付きの滅菌ボトルを使うのが望ましいです。
   2. 水を収集直後に処理する場合は、ボトルを短期間RTに置いておきましょう。後からサンプル処理を行う場合は、ボトルを4°Cに保ってください。
2. サンゴをサンプルして保管してください。
   1. 無菌のペンチを使って、同じ水サンプルのサンゴ片を切断します。汚染を避けるために、無菌手袋でサンゴに触れるのは避けてください。
   2. サンプル採取したサンゴ片は、蒸留水中で3%NaClを含む20mLの無菌塩水溶液または人工海水で洗い流し、海水中にゆるく付着した自由生活細菌を除去します。
   3. 鉗子を使って、各サンゴ片を滅菌した250−500mL容器に、ねじキャップをつけて無菌生理食塩水溶液を入れます。
   4. 実験室では、滅菌鉗子とペンチを使い、無菌の100 mm x 20 mmペトリ皿を計量し、5gのサンゴ片を計量します。
   5. 5gのサンゴサンプルを滅菌乳鉢に移し、滅菌乳棒で浸漬します。
   6. 滅菌ヘラを使い、マセレーションしたサンプルを3% NaCl滅菌溶液45mLと5mmのガラスビーズ10⁻¹5を含む滅菌培養フラスコに移します。45mLの滅菌生理食塩水を使ってモルタルを洗浄し、マセレートの最大量を回収します。
   7. フラスコはサンプリング地点の水温で16時間、常に攪拌(150 x g)状態に保ちます。
      手記： 浅瀬サンゴの最適気温は24−28°Cの範囲です。この工程では、宿主細胞に付着するものや組織や骨格内に生息するものなど、異なるサンゴの区画から微生物を切り離します。この工程の後、サンゴのマセレートは保存せず、分離作業は直ちに行う必要があります。

2. 海水および/またはサンゴから合成エストロゲン17a-エチニルエストラジオール(EE2)分解性細菌の単離

1. 細菌を選びましょう。
   手記： ステップ1.1.2および1.2.7の後、異なるサンゴマセレートから剥離した海水中の微生物濃度は不明で変動します。寒天培地を含むペトリ皿内の個々の微生物コロニーの分離を保証するためには、連続希釈が必要です。
   1. サンゴサンプルには無菌生理食塩水で最大10〜9度、水サンプルには最大10〜6度まで連続希釈を行います。ピペットで5回ずつ希釈してから先端を捨てます。次の連続希釈を行う前に、毎回5秒間ボルテックスをサンプリングします。
   2. 各希釈液を3% NaCl溶菌ブロス(LB)寒天培地にピペット100 μL抽出し、培地に置きます。
      手記： 代替培地として海洋寒天(MA)を使用してください。信頼できる結果を得るには、各希釈の三倍数が必要です。
   3. 標的温度(例:26°C)で1−3日間培養します。1日に1回はナンバープレートをチェックしてください。
   4. ストリークプレート技術を用いて、新しいプレート上で異なる成長形態を示すコロニーを選別・分離します。この工程を必要なだけ繰り返し、純粋な菌群がプレート上で成長します。
   5. 手順がすぐに2.3.1段階で継続されない場合は、分離株を4°Cまたは2.2節に記載されたグリセロールで保存してください。
2. グリセロールストックを用意してください。
   手記： このステップは任意であり、長期の細菌ストック貯蔵にも利用できます。
   1. 新鮮な培地または4°Cで保存された培地から単一コロニーを選び、2 mLの無菌LB培地で独立して接種します。
   2. チューブを24−28°Cで一晩(ON)で一定攪拌(150 x g)下に置きます。
   3. ステップ2.2.2の細菌培養液1 mLと、最終濃度20%まで滅菌グリセロールを2 mLのクライオビアルに加えます。
   4. クライオバイアルは4°Cのままにしておきましょう。
   5. グリセロール菌のストックは必要なら-80°Cに置きます。
3. EE2劣化能力テストを実施してください。
   1. LBブロスや代替培地で分離物を活性化します。この場合は、新鮮なプレートから単一コロニーを選び、4°Cで保存したプレートから2mLの無菌LB培地を接種します。グリセロールストックの場合は、まずLB寒天プレートにストリークし、24−28°C ONで培養して単一コロニーを成長させます。LB培地入りのチューブを、常に攪拌(150 x g)で24−28°Cの傾き状態で置きます。
   2. 細菌増殖後、細胞を8,000 x g で室温(RT)で8分間遠心分離してペレットします。上清液を捨て、優しく上下にピペットしながら、細胞を同じ量(2 mL)の生理食塩水に再懸浮させ、残ったLBブロスを洗い流します。
   3. ステップ2.3.2を2回繰り返し、炭素源の痕跡がないことを確認し、セルを同じ体積の生理食塩水に再懸浮させます。例えば、2 mLの培養から始めた場合、細胞を最終体積の2 mLの生理食塩水溶液に再懸浮させます。
   4. 洗浄・再懸濁された細胞は、EE2のみを炭素源とする最低限のブッシュネル・ハース培養培地(BHブロス)に接種します。
      手記： EE2は培養培地中に最終濃度5 mg/Lのエタノールに溶解します。必要に応じて汚染物質の種類や濃度を変更してください。
   5. LB寒天培地上の600 nmおよび/またはコロニー形成単位(CFU)による細菌増殖を16−72時間の培養期間で評価します。
      手記： あるいは、微生物をEE2や他の化合物を唯一の炭素源として最小限含む培地上で直接分離することも可能です。このステップは選定を導き、望ましくない成長を防ぐためのものでした。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
500 mL PYREX メディア保存ボトル	トーマス・サイエンティフィック/コーニング	1743E20/1395-500	水のサンプリングに使われていました。
500 mL 吸引器ボトル	トーマス・サイエンティフィック/コーニング	1234B28/1220-2X	油分を分離するために使われました。
6インチワイヤーカッタープライヤー	トーマス・サイエンティフィック/レステック	1173Y64/23033	サンゴの破片を切るために使われた。
17a-エチニルエストラジオール	LGC規格	ドレC13245100	選択培地を作る唯一の炭素源として使われています。
寒天	ヒメディア	PCT0901-1KG	固体メディアを作るために使われていました。
ブッシュネル・ハース・ブロス	ヒメディア	M350-500G	最小限の媒体として炭素源を補うために使用されます。
エルレンマイヤーフラスコ	トーマス・サイエンティフィック/DWK生命科学(キンブル)	4882H35/26500-125	ガラスビーズでサンゴのマセレートを抱卵するために使われていました。
ルリア・ベルターニブロス、ミラー(ミラー・ルリア・ベルターニ・ブロス)	ヒメディア	M1245-1KG	細菌を増殖させるリッチ培地として使われます。
マリンアガー2216(ゾベルマリンアガー)	ヒメディア	M384-500G	細菌を増殖させるリッチ培地として使われます。
オービタルシェーカーインキュベーター			液体培地と油の培養に使われました。
プレートインキュベーター			皿を孵化するために使われていました。
磁器モルタルと乳棒	トーマス・サイエンティフィック/ユナイテッド・サイエンティフィック・サプライズ	1201U69/JMD150	サンゴ片の浸漬に使われました。
Qubit 2.0 フルオロメーター	インビトロジェン		DNAおよびPCR産物の核酸定量に使用されます。
冷蔵遠心分離機			細菌培養物の遠心分離に使われていました。
分光 光度 計			細菌培養の光学密度を測定するために使用されました。