海水サンプルから選抜的に分解する海洋細菌の濃縮と分離

要約

出典: Villela, H. D. M. ほか生物修復のための微生物株の探査およびメタオーガニズム研究・保存のためのプロバイオティクス開発。 J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオは、油性培地に海水サンプルを濃縮することで、油分解性の海洋細菌を選択的に分離する方法を示し、原油のバイオレメディエーションや環境浄化に応用できる純粋な株の回収を可能にします。

プロトコル

1. 微生物分離のための水とサンゴの収集と貯蔵

手記： サンプリング地点の座標と温度を把握することが不可欠です。可能であれば、塩分、pH、深さ、光強度などのメタデータも、微調整された栽培方法の発見や将来のデータの解釈に役立ちます。信頼できる結果を得るためには、サンプルを可能な限り最小限の時間保存してください。サンプルが適切な温度で保管されなかったり、長期間保存されると、水やサンゴの微生物叢は大きく変化する可能性があります。分離工程が収集直後に行われない場合、処理までサンプルを4°Cに保つことが重要です。サンプルを4°Cの温度でも長く保管すればするほど、微生物群集の変化は大きくなります。

1. 海水を採取して保存しましょう。
   1. 各対象採取地点から少なくとも3倍の500mLの水サンプルを採取してください。できれば、スクリューキャップ付きの滅菌ボトルを使いましょう。
   2. 水を収集直後に処理する場合は、ボトルをRT(室温)で短期間保ちましょう。後からサンプル処理を行う場合は、ボトルを4°Cに保ってください。
2. サンゴをサンプルして保管してください。
   1. 無菌のペンチを使って、水サンプルと同じサンゴの断片を切断します。汚染を避けるために、無菌手袋でサンゴに触れるのは避けてください。
   2. 採取したサンゴ片は、20mLの無菌生塩水溶液(蒸留水中で3%NaCl(塩化ナトリウム))または人工海水で洗い流し、海水中にゆるく付着した自由生活細菌を除去します。
   3. 鉗子を使って、各サンゴ片を滅菌した250−500mL容器に、ねじキャップをつけて無菌生理食塩水溶液を入れます。
   4. 実験室では、滅菌鉗子とペンチを使い、無菌の100 mm x 20 mmペトリ皿を計量し、5gのサンゴ片を計量します。
   5. 5gのサンゴサンプルを滅菌乳鉢に移し、滅菌乳棒で浸漬します。
   6. 滅菌ヘラを使い、マセレーションしたサンプルを3% NaCl滅菌溶液45mLと5mmのガラスビーズ10⁻¹5を含む滅菌培養フラスコに移します。45mLの滅菌生理食塩水を使ってモルタルを洗浄し、マセレートの最大量を回収します。
   7. フラスコはサンプリング地点の水温で16時間、常に攪拌(150 x g)状態に保ちます。
      手記： 浅瀬のサンゴの最適温度は24−28°Cの範囲です。この工程では、宿主細胞に付着するものや組織や骨格内に生息するものなど、異なるサンゴの区画から微生物を切り離します。この工程の後、サンゴのマセレートは保存せず、分離作業は直ちに行う必要があります。

2. 海水やサンゴから油を分解する細菌の分離

1. 油、水溶性分率(oWSF)と油水不溶性分率(oWIF)を唯一の炭素源として含む最小限の培地を準備します。
   1. 500mLの滅菌蒸留水に原油1−2%を加えます。底に開けたフィルターフラスコを使って、不溶性部分の上層を乱さずに溶解性部分を除去します。
   2. 混合物は24−28°C、150 x g で48時間かけて常に攪拌します。
   3. 原油分画を含むフィルターフラスコを安定した表面に置き、10−20分待って可溶性と不溶性分の分離を待つ。
   4. oWSFを新しい滅菌フラスコに移し、下部のフィルターフラスコを開けて可溶性成分を取り除いてoWIFを保存します。
   5. 前段階で回収したすべてのoWSF(~400 mL)を用いて、oWSFを唯一の炭素源として含むBH(ブッシュネル・ハース)寒天最小培地1リットルを準備します。
   6. ステップ2.1.4でフラスコに残ったoWIFを用いて、oWIFを唯一の炭素源とする最小培地1リットルのBH寒天培地を準備します。
2. oWSFおよびoWIF分解菌を単離する。
   1. ステップ1.1.2および1.2.7の水とサンゴのマセレートをそれぞれ用いて、以下の通り無菌生理食塩水溶液で最大10^〜6 %希釈します。
3. サンゴサンプルには無菌生理食塩水で最大10^〜9 度、水サンプルには最大10^〜6 度まで連続希釈を行います。ピペットで5回ずつ希釈してから先端を捨てます。次の連続希釈を行う前に、毎回5秒間ボルテックスをサンプリングします。
4. BH-oWSFおよびBH-oWIF寒天培地にそれぞれ希釈した100μLのピペットをペトリ皿に抽出し、プレートにします。
5. 標的温度(例:26°C)で1−3日間培養します。1日に1回はナンバープレートをチェックしてください。
6. ストリークプレート技術を用いて、新しいプレート上で異なる成長形態を示すコロニーを選別・分離します。この工程を必要なだけ繰り返し、純粋な菌群がプレート上で成長します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
500 mL PYREX メディア保存ボトル	トーマス・サイエンティフィック/コーニング	1743E20/1395-500	水のサンプリングに使われていました。
500 mL 吸引器ボトル	トーマス・サイエンティフィック/コーニング	1234B28/1220-2X	油分を分離するために使われました。
6インチワイヤーカッタープライヤー	トーマス・サイエンティフィック/レステック	1173Y64/23033	サンゴの破片を切るために使われた。
寒天	ヒメディア	PCT0901-1KG	固体メディアを作るために使われていました。
ブッシュネル・ハース・ブロス	ヒメディア	M350-500G	最小限の媒体として炭素源を補うために使用されます。
エルレンマイヤーフラスコ	トーマス・サイエンティフィック/DWK生命科学(キンブル)	4882H35/26500-125	ガラスビーズでサンゴのマセレートを抱卵するために使われていました。
層流フード			無菌環境で作業する必要がありました。
ルリア・ベルターニブロス、ミラー(ミラー・ルリア・ベルターニ・ブロス)	ヒメディア	M1245-1KG	細菌を増殖させるリッチ培地として使われます。
マリンアガー2216(ゾベルマリンアガー)	ヒメディア	M384-500G	細菌を増殖させるリッチ培地として使われます。
オービタルシェーカーインキュベーター			液体培地と油の培養に使われました。
プレートインキュベーター			皿を孵化するために使われていました。
磁器モルタルと乳棒	トーマス・サイエンティフィック/ユナイテッド・サイエンティフィック・サプライズ	1201U69/JMD150	サンゴ片の浸漬に使われました。
冷蔵遠心分離機			細菌培養物の遠心分離に使われていました。
分光 光度 計			細菌培養の光学密度を測定するために使用されました。
ウィザード ゲノミックDNA精製キット	プロメガ	A1120	微生物株のDNA抽出に使用されます。