マイクロ流体システムにおける細菌増殖を単細胞分解能で追跡

要約

出典:ケイビーン、M. T.らバチルス・サブティリスの単細胞マイクロ流体解析。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、マイクロ流体装置を用いて単細胞レベルで細菌の増殖を観察する方法を実演しています。微小スケールの溝内に閉じ込められた非運動性細菌細胞が、蛍光顕微鏡で継続的に栄養を得て画像化されている様子を示しています。このセットアップにより、細胞分裂や系統追跡のリアルタイム可視化が複数世代にわたって可能となります。

プロトコル

1. PDMSデバイスキャスティング

1. 塵のない環境で、ポリジメチルシロキサン(PDMS)ポリマーと硬化剤を10:1の比率で混合し、真空下で少なくとも10分間脱ガスします。
2. シリコンマスター(またはそのエポキシやポリウレタンのレプリカ)を、割れていないアルミホイルの上にポリスチレンペトリプレートの上に置きます。脱気されたPDMS混合物をマスターに約5mmの深さまで注ぎます。ペトリプレートを少なくとも10分間脱ガスしてください。表面の泡を割るために優しい風の流れを使ってください。
   手記： プラスチック製レプリカマスターは脱ガス時に部分的に浮くことがあります。もしそうなら、清潔なプラスチック製アプリケーターでレプリカを押し下げてください。
3. PDMSは60°Cのオーブンで少なくとも1時間硬化し、室温まで冷やします。マスターと硬化したPDMSをペトリプレートから取り除きます。マスターの背面からアルミホイルを慎重に剥がし、次にPDMSも慎重に剥がします。
   手記： または、PDMSは室温で一晩硬化させることもあります。シリコン・ウェハーマスターの相対的な脆弱性は、エポキシ接着剤を用いてウェハーと同じサイズの厚さ1/16インチのアルミニウムディスクに永久接着することで克服できます。
4. ウェハは通常、わずかに異なる寸法の複数のマイクロ流体デバイスを含むため、清潔で鋭いメスで1つのデバイスをサイズに合わせて切断します。
   手記： 通常の バチルス・サブティリス の研究には、1.0μm幅の細胞溝を持つ装置を使用してください。

2. デバイスパンチングと接合

1. パターンのある側面に半透明のオフィステープ(材料 表参照)を貼り、パターンの特徴の視認性を高めます。入口と出口のポートは、目に見える流体チャネルの両端にある円形の領域として識別されています(図1)。入口と出口のピンに穴を開ける際に視認性を高めるために、細かい先端のマーカーで入口と出口に点をつけて印をつけてください。
   手記： インレットピンとアウトレットピンが混雑しないようにするため、デバイスのアルファベット指定子のすぐ下のチャネルから、1つのチャンネルごとにパンチが行われます。
2. PDMSデバイスを反転させてパターン面を下にし、0.75mm生検パンチでマークされた点までパンチします。パンチは捨てて。
   手記： これらの装置はパターン面が下向きでパンチされます。これは、生検パンチによって開く穴が通常、パンチがポリマーに入る部分でわずかに広がっているためです。逆向きにパンチを打つことで、パターン面の穴に鋭い縁取りができます。
3. 立体顕微鏡を使い、開けた穴が装置の入口および出口部と重なっていることを確認します。細かいピンセットを使って、穴から余分なPDMSの破片を取り除きます。
4. テープでデバイスの両側のほこりを取り除き、きれいな発泡スチロールのペトリプレートに貼り付けます。22 mm x 40 mmのカバーガラスを100%イソプロピルアルコールで濡らし、クリーンルーム用のワイプで擦り込んで準備します。ダストのない空気や窒素の流れで乾燥させてください。
5. パンチされたPDMSデバイスの機能を、洗浄したカバーガラスと一緒に上向きに酸素プラズマクリーナーに入れます。
   1. プラズマ処理は以下の設定で行う:真空、70 mTorr;酸素圧、200 mTorr;演奏時間:15秒;出力:30W。プラズマ処理期間終了後すぐに、装置を取り出し、プラズマクリーナーのガラスを覆いましょう。
   2. PDMSを反向きにして、カバーガラスの中央に置き、パターン面がガラスに接触するようにします。吸気と出口の間を通る給水チャネルがカバーガラスの長軸に沿って整列していることを確認しましょう。PDMSがガラスに密着するように、非常に優しく押し下げてください。
6. 組み立てた装置を60°Cでオーブンで少なくとも1時間焼きます。焼き上げた後、PDMSがガラスに接着しているか手動で、デバイスの一角を優しく押して確認します。
   手記： デバイスが結合された後は、プラズマ処理後時間が経つにつれてポリマーがますます疎水性になるため、24時間以内に使用してください。

3. マイクロ流体配管準備

1. ポリマーチューブの長さ(内径(ID)0.02インチ、外径(OD)0.06インチ)を、注射器ポンプからスイッチング装置(使用時)および顕微鏡に取り付けた装置に届く適切な長さに切断します。マイクロ流体レーンの数だけ長さをカットしてください。
2. ピンチバルブ用のY字接合部(使用する場合)は、「Y」の上部バーブに2cmの柔軟なシリコーンチューブ(内径0.03インチ、外径0.065インチ)を切断・取り付け、下部バーブに1cmのシリコーンチューブを取り付けます。
3. 10cm(または適切な長さ)のポリマーチューブを切断します。Y字の下部バーブにある1cmのシリコーン管セグメントに挿入して、片端をスイッチの接合部に接続します。反対側の端を、プラスチック製のシリンジアダプターから取り外し、針端から約90°から9mm程度曲げた21Gの針に接続します。
4. 21Gの鈍針を、注射器からスイッチ装置へと繋ぐチューブセグメントの一端に、針をチューブに差し込んで接続します。各管の長さの他の端をY字接合部のシリコーン管セグメントに挿入します。
   手記： ピンチバルブや接合部を固定する装置を使います。これはマイクロピペットのチップボックスから簡単に作ることができます(図2D)。
5. ポリマーチューブの長さを切断し、装置の出口から廃棄物ビーカーへ廃棄物を運びます。一方の端を、上記のように曲げた21G針に接続します。チューブのもう一方の端を廃棄ビーカーにテープで固定します。
6. 0.1 mg/mLの牛血清アルブミン(BSA)を含む適切な量の培地を準備し、希望のサイズと数の注射器を充填します。BSA装填シリンジを、インレットチューブに取り付けられた21Gの針に接続し、シリンジポンプに注入します。
   手記： 典型的な実験では、装置の5つのチャネルが使用され、それぞれ20mLの注射器が使われます。培地を切り替える実験では、2つのバンクにそれぞれ5本ずつの注射器が必要です。ここで、最初のバンクを含むポンプは相1ポンプと呼ばれ、スイッチ後媒体を含む第2バンクを含むポンプは相2ポンプと呼ばれます。
7. 吸気口の空気を排出するには、シリンジポンプを高流量(>500 μL/min)で動かし、まずシリンジポンプを垂直に配置し、シリンジをタップして空気の泡を上部に導きます。注射器から空気が排出されたら、注射器ポンプを水平に置き、注射器からポリマーラインを段階的にタップまたは弾きながらスイッチ装置を通って空気の泡を抜き、排出します。このプロセスを2本目の注射器群(メディアを切り替える場合)にも繰り返します。
8. 気泡を除去した後、フェーズ2シリンジポンプ(スイッチ後に次に使用する培地)を1.5 μL/minに設定し、流れを一時停止します。Y字接合部の第2中間相に対応する柔軟なチューブのセグメントに小さなバインダークリップを取り付けます。フェーズ1シリンジポンプを控えめな流量(例:10 μL/min)で少なくとも30分間稼働させ、Y字接合部下流の入口チュービングから2番目の媒体を排出してください。

4. 細胞培養調製

1. 目的の培地で興味株の前培養株を一晩で培養し、定止期まで行います。細菌株には細胞が動けなくなる変異が含まれており、細胞が装置のチャネルから泳いで出ていけないようにします。
   手記： このプロトコルでは、細菌株は B. subtilis 3610で、 hagA233V置換(この変異により鞭毛が螺旋状ではなく直線化し、細胞運動性を妨げる)、細胞ストレス用のPrsbV-mNeonGreenリポーター、細胞を強調するPhyperspank-mNeptune(赤色)リポーターを含みます。例のプロトコルではLuria-Bertani(LB)Lennox培地が使用されています。マイクロ流体実験の典型的な株には、1つ以上の蛍光転写レポーターと、細胞の自動検出を促進するために恒定的に産生される細胞質蛍光タンパク質が含まれています。LB Lennoxリッチ培地を使用した場合、成長欠陥は観察されませんでしたが、最小限培地での B. subtilis の増殖は、分泌されたサイドロフォアが培地の流れによって洗い流されるため、微小流体条件下で抑制される可能性があります。このような条件下では、S750培地で報告されているように、シエン酸ナトリウムと塩化鉄を培地に加えることで成長が回復することもあります。
2. 実験当日の朝、 B. subtilis 細胞を250mLの培養培地を含むバッフルされた250mLフラスコに1:50希釈します。細胞を37°Cの揺らし培養で5〜6時間、光学密度1を超えるまで培養します。
   手記： 高密度細胞培養は、定常相の B. subtilis 細胞が小さく、細胞鎖内であまり見られないため、デバイス負荷を容易にするため好ましいです。異なる細菌種は最適な負荷のために他の培地や成長条件を必要とする場合があります。
3. 5μmの孔径フィルターを装着した注射器を使い、約15mLの細胞培養を15mL円錐形チューブにろ過して B. subtilis 細胞鎖を除去します(大 腸菌 には不要で、他の種では不要かもしれません)。
   手記： 比較的少数の細胞を除去すべきであり、ろ過液は濁っているべきです。
4. ろ過した培養液を室温で4,000 x gで10分間遠心分離します。上澄液を注ぎ、チューブ内に残った残留上清液に細胞ペレットを再懸浮させ、必要に応じて約500μLの新鮮培地を加えて細胞懸濁液のピペッティングを容易にします。

5. 装置の装填

1. 空の薄いゲルローディングマイクロピペットの先端( 材料表参照)をマイクロ流体装置の出口穴に優しく挿入します。
2. P200マイクロピペットを用いて薄いゲルローディングチップを使い、1 mg/mL BSAを含む培地を入口穴に注入し、出口孔のチップを観察してマイクロ流体チャネルの充填状況を監視します(図2A)。装置を室温で約5分間孵化させます。
   手記： BSAは一般的に遮断剤や不動化剤として用いられ、PDMSポリマーの疎水性表面に結合し、親水性を高め、他のタンパク質や細胞(細胞表面分子を介して)との結合を減少させます。
3. 薄いゲルローディングチップを使い、各チャネルに再懸濁セル(セクション4より)を積み込み、出口チャネルのチップでセルの進行状況を監視します(図2B)。
   手記： 装填は、P200マイクロピペットを最大200μLの容量に設定し、空気のクッションを吸引してから、ピペット先端の薄い部分の約半分の少量の細胞を吸引することで容易に行います。再懸濁セルの体積は正確である必要はありません。なぜなら、PDMSデバイスの体積はマイクロピペットに比べて小さいからです。リサペンドセルの密度に上限はなく、セルの懸濁液がピペットでデバイス内に取り込まれる限りは分かっていません。細胞の塊は装置を詰まらせるため、徹底したピペッティングや渦混合によって避けるべきです。
4. 出口の穴からジェルローディングチップを優しく取り外し、一度に一つずつ作業して機器の損傷を防ぎます。
5. 装置をベンチトップのマイクロ遠心分離機で、適切なローターアダプターで約6,000 x gで10分間遠心分離します(図2C)。
   手記： マイクロ遠心分離機ローターに適合するよう設計されたカスタム加工のアルミニウム製ローターアダプター(図2C)が使用されました。異なる遠心分離機モデルと適切なローターアダプターが使用されることがあります。アダプターの重要な特徴は、セル溝の閉鎖端に方向に横方向の力を与え、セルを側のチャネルに押し込むことです。
6. 顕微鏡下で装填が成功しているか確認します(図3)、ただしデバイスをスライドホルダーやステージインサートに固定せずに。
   手記： このプロトコルでは、この段階での検証およびその後のイメージングの両方に、60X、1.4 NA Ph3の油浸け物鏡を使用しています。

6. デバイスの組み立て、平衡、取り付け

1. 装填済みデバイスをステージインサートに慎重に取り付ける際、PDMSの両側のカバーガラスをステージインサートの底部にテープで貼り付けます(つまり、デバイスを取り付ける前にステージインサートを逆さまにして)。段インサート・デバイスアセンブリを逆さまにしてPDMSを上向きにし、ほこりのないワイプ(図2D)などの柔らかい表面に置きます。
2. フェーズ1シリンジポンプの流量を35 μL/minに調整してください。一度に1レーンずつ作業し、インレットニードルを挿入し、次に排気口ニードルを挿入します(つまり、廃棄物ビーカーへ向かって; 図2E)。
3. 余分な媒体は清潔で埃のないワイプで拭き取り、漏れがないか目視で点検してください。排出チューブの余分な細胞(通常は濁ったストライプとして現れる)や、中半月板の外観を調べてください。これらはゆっくりと廃棄物ビーカーに向かって移動します。
4. 装置を35 μL/minで約15〜30分間稼働させ、接続されたすべてのレーンが廃棄物ビーカーに排水されるまで待ちます。
5. フェーズ1シリンジポンプを1.5 μL/minに設定し、流れを一時停止します。ポンプと装置全体を顕微鏡に持っていき(この工程はローリングカートに載せることで補助)、相1培地の流れを1.5 μL/minで再開始します。装置付きのステージインサートを倒さした蛍光顕微鏡に慎重に取り付け、必要に応じてテープを使って入口と出口のチューブを通します。
6. 画像撮影のためのデバイス上の望む位置を特定し、希望通り撮影を開始します。細胞は通常、定常状態の指数関数的相成長に達するまでに数時間(約10世代)かかり、画像取得の開始を希望に応じて遅らせて、平衡期間後に画像撮影を開始することができることに注意してください。
   手記： 指数位相に保持された細胞の定常成長は、細胞分裂時間を追跡し、一定の最小値に達していることを確認することで、その後の画像解析で検証されるべきです。

結果

図1:マイクロ流体装置の回路図。 デバイスの回路図はおおよそのスケールで示されています。アルファベットの指示符は、鈍い針を接続するために打孔された入口および出口ゾーンとともにラベル付けされています。通常、パターン付きチャンネルの半分(グレー)が使われます。セルトレンチは指示子に向かって配置されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シルガード184シリコーンエラストマーキット	ダウコーニング	(240)4019862	これはプロトコル内でPDMSと呼ばれています。10:1の比率で混ぜられる成分は2つあります
0.75mm生検パンチ	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ	504529
22 x 40 mm No. 1.5 カバーガラス	VWR	48393 172
プラズマエッチPE-50	プラズマ・エッチ社	PE-50	酸素プラズマ処理を用いてPDMSをガラスに結合させるための機器
タイゴンフレキシブルチューブ 内径0.02インチ、外径0.06インチ	サンゴバンPPLコーポレーション	AAD04103	チューブの主要部分、例えば針に取り付ける場合など
シリコーンチューブ、内径0.04インチ、外径0.085インチ	HelixMark標準シリコーンチューブ	60-795-05	ピンチバルブおよびY字接合のため
牛血清アルブミン	シグマ・オルドリッチ	A7906-100G	不動化剤として使用
ARTジェルピペットチップ(P200)	分子バイオプロダクト	2155	媒体とセルをデバイスに積み込むために
アクロディスク32mmシリンジフィルター(5μmスポール膜付き)	パル・ライフ・サイエンス	4560	装置充填前の培養のろ過用
21ゲージ鈍針、1インチ	マクマスター・カー	75165A681
Yコネクター、200シリーズバーブ、1/16インチ内径チューブ、ポリプロピレン	ノードソン・メディカル	Y210-6005	その会社は別名バリュープラスチックスです
エクリプスTi-E倒立顕微鏡	ニコン		このユニットはメーカーによって生産終了となり、Ti 2 Eに置き換えられています。
LBレノックス	シグマ・オルドリッチ	L3022
マイクロフュージ18	ベックマン・カウルター	367160
バチルス・サブティリス 株NCIB3610	バチルス 遺伝的ストックセンター	3A1	このプロトコルで示された実験用に改造された野生型親株
重力対流オーブン	VWR	414005-106	PDMSの硬化および組み立て済みデバイスの焼成のために
スコッチウェルドエポキシキット	3歳	2216 B/A	シリコンウェハをアルミニウム裏板に接合するために使用されることがあります
スコッチマジックテープ、幅3/4インチ	3歳		PDMS機器のほこりを除去し、機能に重ねて視認性を高めるために(プロトコルでは「オフィステープ」または「接着テープ」と表記)
立体顕微鏡	ニコン	SMZ800N	ここに例を挙げます。ほぼどんな立体顕微鏡でも問題ありません
イソプロピルアルコール	シグマ・オルドリッチ	W292907	カバーガラスをきれいにするために
シリングポンプ、6チャンネル	ニューエラ・ポンプ・システムズ社	NE-1600
キムワイプズ	キンバリー・クラーク	34120	ほこりフリーのワイプブランド