マイクロ流体装置を用いた細菌の運動性評価

要約

出典: Scheidweiler, D., 他 流体装置と顕微鏡、フローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを超えた多孔質培地内の微生物輸送を研究すること。 J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオは、マイクロ流体装置を用いて、ランダムに配置された柱で構成された多孔質マトリックスを通じて細菌の運動能力を定量化する方法を示しています。蛍光標識された細菌を装置内に導入し、顕微鏡で観察チャネルに入りながら画像化し、解析してブレークスルーカーブ(BTC)を生成します。

プロトコル

1. 細菌培養条件

1. 層流フードの下で作業し、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付き Pseudomonas putida KT2440(1 ×^{10 7 mL-1}、-80°Cで保存)のグリセロールストック100 μLを用いて、5 mLのLuria-Bertani(LB)培地を接種します。30°Cで250rpmで振って一晩孵化します。
2. 翌日、100μLの一晩培養液を5mLのLB培地に再懸浮させ、同じ条件下で5時間(指数関数的相)培養します。1 mLのアリコートを2 mLのチューブにサンプルし、室温(~15分)まで冷却し、遠心分離機(2300 x g 、5分)します。
3. 上澄液を取り除き、ペレットに1 mLの運動性バッファーを加えます。サンプルを均質化するために一時的に渦を流します。希望する細胞濃度(例:5×10^{5 mL-1})まで希釈します。
4. 小川由来の自然群集を含む実験では、非選択的な栽培培地を準備します。例えば、滅菌ろ過・オートクレーブされた川水や、複雑な炭素源(LB媒体)を添加した人工の水媒体を使用します。

2. ポリジメチルシロキサン(PDMS)中のマイクロ流体装置の製備

1. コンピュータ支援製図(CAD)ソフトウェアを用いて、半径サイズと中心座標で表される円の行列(すなわち不透水の流れの障害物)を用いて、望ましい多孔質ジオメトリを設計します。
   注:ランダム化された粒径と孔径を持つ多孔質形状の例は 図1Aに示されています。出口近くに障害物のない観測チャネルは、突破曲線(BTC)の取得を容易にします。
2. 選択した形状に基づいて、標準的なSU-8フォトリソグラフィーを使って型を準備します。
   注:または、専用のマイクロファブリケーション施設から金型を注文することも可能です。水平面で不均一な流体の流れを得るためには、マイクロ流体チャンバーの厚さを平均的な孔径サイズと同じ桁数に設計することが重要です。ただし、マイクロ流体装置の寸法が顕微鏡下での観察(例:顕微鏡スライド作業)に適していることを確認してください。
3. 針を使わずに注射器を使い、針を使わずにエラストマーの重量90%に架橋剤(ジメチル、メチル水素シロキサン共重合体)を10%加えて50gのPDMSを調製します。清潔な環境で作業し、できるだけほこりを避けましょう。2つの試薬を清潔な使い捨て容器で混ぜ、真空(100 mbar)を30分間かけて粘性のPDMSから溶けた空気や気泡を除去します。
4. 型を直径100mm、高さ15mmのペトリ皿に入れます。PDMSを金型に希望の高さ(例:2〜5mm)まで注ぎ込みます。ペトリ皿を蓋をして60°Cで4時間(厚い層の場合は一晩)乾燥させます。
   注:可視化の目的で、光はPDMSを通過できる必要があります。したがって、2mmから5mmの薄い層が望ましいです。厚い層(>5mm)はデバイスの透明度を低下させ、薄い層は塗布中に変形します。
5. 型をオーブンから取り出し、マイクロ流体装置を室温まで冷やします。冷却が終わったら、メスで目的の部分を慎重に除去します。
   注意:金型に強い圧力がかかると、型の亀裂が生じます。素手でPDMSに触れないでください。指紋は光学的透過に影響を与えるためです。
6. PDMSチャネルの底部(目的のジオメトリが刻印された部分)をテープで一時的に封印します。直径0.5mmの生検パンチャーを使い、マイクロ流体チャネルを貫通して、0.5mm(内径)チューブを収める入口と出口を作ります。
   注意:PDMSの柔らかい特性により、チューブ挿入後の締め付けが保証されます。PDMSがガラスに密閉された後は、入口と出口チャネルを作ることはできません。
7. 高周波発生装置(プラズマ結合器、 材料表)を用いて酸素プラズマ結合によりマイクロ流体チャネルを密閉します。そのため、ケイ酸塩ガラススライド(25mm x 75mm)をエタノールで洗浄し、乾燥させます。PDMSチャンネルからテープを取り出し、多孔質面を上向きにしてチャンネルを置きます。シリケートガラススライドとPDMS表面を室温で約45秒間プラズマで処理します。
8. PDMSチャネルをシリケートガラスのスライドに置き、ホットプレートで100°Cで30分間加熱します。
9. マイクロ流体装置をホットプレートから取り外し、室温まで冷却します。PDMSチャネルのインレットをチューブで接続してください。PDMSから空気を30分間吸い取ります。PDMSは流体にはほとんど不透過ですが、ガスには透過性があります。
10. 運動性バッファー100mL(10 mMリン酸カリウム、0.1 mMエチレンジアミネトラ酢酸(EDTA)、1%のw/vグルコース、pH 7.0を補足)を準備し、10 μL ^min-1で動作するシリンジポンプでマイクロ流体装置に1mLを注入します。
    注:PDMSは前回の真空ステップによりガスで過飽和状態にあるため、気泡は~30分以内に消えます。

3. PDMSマイクロ流体装置を用いた細菌輸送解析

1. PDMSマイクロ流体装置を、運動性バッファーで事前に飽和させていたものを顕微鏡ステージに置きます。テープを使ってチューブを固定し、ステージ移動中の流れの乱れを最小限に抑えましょう。
2. 顕微鏡ステージを出口近くの観察チャンネルに移動させます。明視野顕微鏡や位相差を用いて、観測チャンネルの中心に焦点を合わせ、倍率を調整して個々の細菌細胞を可視化します。
3. 光路設定を蛍光顕微鏡に切り替え、カメラの露光時間を調整して個々の細菌細胞を分解可能にします(例:100ミリ秒)、または細胞の蛍光信号が背景雑音の少なくとも3倍強くなるようにしてください。
4. 次に、吸気チューブを細菌の懸濁液を含む2 mLのチューブに挿入します。ポンプの方向を逆転させ、1 μL分1の流量でサスペンションの引き出しを開始します。
5. 観測チャンネル全体の断面をスキャンし、実験期間中2分ごとに合成画像を記録します。

結果

図1:多孔質媒体中の微生物輸送を研究するための流体装置 (A) ポリ(メチルメタクリレート(PMMA)からミルされた流体装置の図。多孔質マトリックスは装置の基底層にミルされ、蓋はネジで閉じられます。断面図は流体装置内の柱の配置を示しています。インサートは、規則的な間隔の柱のグリッドとそれぞれの速度流場を持つ多孔質マトリックスを示しています。(B) ポリジメチルシロキサン(PDMS)装置は顕微鏡用ガラススライドに取り付けられます。ここに、それぞれメディアリザーバーとシリンジポン...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)	シグマ
エラストマー・シルガード 184	ドウシル	101697
フローサイトメーター NovoCyte	アシア
グルコース	シグマ		https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
ルリア・ベルターニ(LB)スープ	BD
液体ディスペンサー、XYプロッターロボットキット	メイクブロック
顕微鏡アクシオイメージャー	ツァイス
顕微鏡アクシオズーム v16	ツァイス
顕微鏡スライド、75 mm × 25 mm	コーニング
ミニパルス3 蠕動ポンプ	ギルソン
プラズマ結合機 コロナSB	ブラックホール研究所
リン酸カリウム	シグマ
シリンジポンプ ニューエラ NE 4000	新時代
シト13 緑色蛍光核酸染色	分子プローブ、インビトロジェン
タイゴンチューブ	イスマテック
WF31SA ユニバーサルフライス盤	ミクロン