細菌エフェクタータンパク質を発現する細胞への誘導性遺伝子発現系のトランスフェクション

要約

出典: ベレンズ、C. ほか。 誘導性発現システムを応用して、細菌病原性因子が細胞内シグナル伝達に干渉する様子を研究すること。 J. Vis. Exp. (2015年)

この動画では、細菌のエフェクタータンパク質CaeBが宿主のアポトーシスカスケードを破壊する場所を特定するために誘導型発現システムを用いる方法を示しています。この研究は、CaeB発現細胞をテトラサイクリン応答系でトランスフェクトし、プロアポトーシス遺伝子発現を誘導し、カスケード内の破壊点を特定する手順を概説しています。

プロトコル

1. 誘導性発現ベクター系を用いた安定細胞株のトランスフェクション

1. 12ウェルプレート上で、1×10⁵ 細胞密度で緑色蛍光タンパク質(GFP)またはGFP-CaeBを安定的に発現するヒト胚性腎臓(HEK)293細胞。
2. シード後19時間後、Baxまたは活性化されたカスパーゼ3をコードする調節プラスミドおよびレスポンスプラスミドと共トランスフェクトします。
   1. 安定したHEK293細胞を、pWHE125-P調節プラスミド100 ng(図1)および応答プラスミドpWHE655-hBaxまたはpWHE655-revCasp3(図2)、および0.4 μlのポリエチレンインと共トランスフェクトします。
   2. デオキシリボ核酸(DNA)とポリエチレンミントランスフェクション試薬をそれぞれ75μlのOpti-MEM培地で準備し、室温(RT)で正確に5分間培養します。複合体形成の場合は、両方の混合物をRTで15分間一緒にキュベートします。
3. ポリエチレンミン/DNA溶液を細胞に滴下して加え、5%_CO2で37°Cで培養します。

2. アポトーシスの誘導

1. トランスフェクション後5時間後、培養培地に1 μg/mlのドキシサイクリンを加えてプロアポトーシスタンパク質の発現を誘導します。細胞を37°Cで5%_CO2で18時間培養します。

結果

図1。調節プラスミドpWHE125の概観。 細菌内での増殖に不可欠な要素、例えば複製起点(ori pBR)やアンピシリンに対する抗生物質耐性カセット(Amp^R)、そしてテタト遺伝子伝達物質の発現に不可欠な要素として、ヒト巨型サイトメガロウイルスの強力で構成的な即時早期プロモーター/増強体(P/E_hCMV)、ポリオウイルスの内部リボソーム結合部位(PV-IRES)、シミアンウイルス40のpolyA部位(SV40...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	生命技術	31966-021
FCS	バイオクロム	S0115
ペン/溶連菌	生命技術	15140-122
OptiMEM	生命技術	51985
エクストリーム遺伝子9	ロシュ	6365752001
ポリエチレンニミン	ポリシエンス	23966
ドキシサイクリン	シグマ・オルドリッチ	D9891