遺伝子組み換え細菌細胞における標的酵素発現の検出

Abstract

出典: Kim, H. 他、 『高スループット遺伝子酵素スクリーニングシステムを使った多酵素スクリーニング』。 J. Vis. Exp. (2016年)

この動画では、メタゲノム的フォスミドライブラリーと染色基質を用いて酵素発現を検出する遺伝子スクリーニング法を示します。フローサイトメトリーは、着色生成物を生成する単一細胞を同定・分離し、活性酵素発現細胞の高スループット選択を可能にします。

Protocol

1. p-ニトロフェノール(pNP)(pNP-GESS)検出のための遺伝子酵素スクリーニングシステムを用いたメタゲノムライブラリの準備
   1. フォスミドライブラリー生産キットを用いて、フォスミドベクターを用いて 大腸菌 のメタゲノムライブラリーを構築します。
   2. ライブラリーを−70°Cで保存するために100μlを別取りし、これはメタゲノムライブラリ細胞の供給源となります。
      手記： このライブラリストックの600 nm(OD₆₀₀)波長で測定された試料の光学密度は約100です。
   3. ストックメタゲノムライブラリー100 μlを氷で解凍し、500 mLのフラスコに接種します。そのフラスコには50 mLのルリア・ベルタニ(LB)と12.5 μg/mlのクロランフェニコールが含まれており、その後37°Cで2時間の培養を行います。
   4. 細胞を50mlの円錐形チューブで、1,000 x gで遠心分離し、4°Cで20分間採取します。
   5. ペレットを50mlの氷冷蒸留水(DW)に素早く再懸浮させ、1,000 x gで遠心分離機で再び4°Cで20分間加熱します。
   6. ペレットを10%(v/v)グリセロールを含む50μlの氷冷DWに再懸浮させます。このセルのアリコートを50μl使用して電気穿孔を行います。
   7. 電気適合細胞50μlとpGESS(E135K)DNA(100ng)の混合物を氷冷の電気孔孔キュベットに入れ、混合物を電気孔化(1.8 kV/cm、25 μF)します。
   8. カタボライト抑制(SOC)培地を素早く1mlの超最適なブロスに加え、細胞を優しく再懸浮させます。
   9. 細胞をピペットで14mlの丸底チューブに移し、37°Cで1時間培養します。
   10. 回収した細胞500μlを、クロランフェニコール12.5μg/mlとアンピシリン50μg/mlを含むLB(20×20cm)の正方形プレートに広げます。プレートを30°Cで12時間孵化します。
   11. 細胞スクレーパーでコロニーを削り取り、氷冷のセル保存培地で50mlの円錐形チューブに細胞を集めます。
   12. 遠心分離機で1,000 x gで4°Cで20分間加熱。ペレットを10mlの氷冷セル保存培地に再懸浮させ、OD₆₀₀ /100にします。
   13. −70°Cで保存用に20μlの細胞をアリコートします。
        
2. メタゲノムライブラリからの偽陽性の除去
   1. ステップ1.13のメタゲノムライブラリー細胞(メタゲノムDNAフォスミドとpGESS(E135K)を含むストックのメタゲノムライブラリー細胞を氷で解凍します。
   2. 細胞10μlを2mlLBに接種し、50μg/mlのアンピシリンと12.5μg/mlのクロランフェニコールを14mlの丸底チューブに接種します。37°Cで200rpmで振って4時間孵化します。
   3. その間に、蛍光活性化細胞選別機(FACS)を起動し、デフォルトのFACSソフトウェアを起動してください。以下の設定を使用してください:ノズル先端直径70μm;前方散乱面積(FSC-A)感度、300 V対数増幅;側散乱面積(SSC-A)感度、350 V対数増幅;フルオレセイン・イソチオシアネート面積感度(FITC-A)、450 V対数増幅;しきい値パラメータ、FSC-Aの値5。
      手記： 材料表に記載 されているFACS装置の典型的な設定が示されています。他のFACS機器の設定を調整してください。
   4. ステップ2.2のメタゲノムライブラリー細胞を希釈し、5μlのサンプルを1mlリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)入りの丸底チューブに加えます。
   5. 希釈したライブラリサンプルをFACS機器のロードポートに置き、FACSソフトウェアの取得ダッシュボードで「ロード」ボタンをクリックします。
   6. ダッシュボードのフローレートボタンをクリックしてコントロールすることで、イベントレートを1,000〜1,500イベント/秒に調整できます。
   7. ツールバーのDot Plotボタンをクリックして、グローバルワークシート上で 対数スケール のFSC-Aと対数スケールのSSC-A散布図を作成できます。ツールバーのポリゴンゲートボタンを使って、スキャッターゲートR1をシングルレットイベント(細菌の集団)を含み込むように調整します。
   8. ヒストグラムボタンをクリックして、ワークシート上でセル数 と 対数スケールのFITC-Aを区別したヒストグラムをプロットします。次に、検査制御ウィンドウのサイトメーター設定タブからFITC電圧を調整し、ベル型分布のピークがFITC-A^の 102倍未満になるようにします。
   9. 対数スケールのFSC-A を作成するグローバルワークシートのドットプロットボタンをクリックしてログFITCプロットを作成します。ツールバーのポリゴンゲートボタンを使ってプロット上にソートゲートR2を設定し、ゲートが分布の中心から+5%から-5%セル(ベル型曲線の頂点周辺の合計10%セル)に位置するようにします。
   10. FACS機器の出口に1.2 ml LBの50 μg/mlアンピシリンおよび12.5 μg/mlクロランフェニコールを含む採取チューブを置き、R1ゲートとR2ゲートの両方を満たす10個^の6 細胞を選別します。
   11. 集水チューブとキャップを外し、そっと渦を巻きます。
        
3. メタゲノム酵素スクリーニング
   1. ステップ2.11以降の選別セルを37°Cで200rpmで振ってOD₆₀₀ が0.5に達するまでキュベートします。
   2. 細胞内フォスミドのコピー数を増幅するために1μlのコピー誘導液を加えます。細胞を37°Cでさらに3時間、250rpmで振って培養します。
   3. 細胞の選別準備として、培養細胞0.5mlと適切な基質(p-ニトロフェニル酢酸塩、p-ニトロフェニルβ-D-セルロバイオシド、またはフェニルリン酸)を14mlの丸底チューブに最終濃度100μMで加えます。
      1. 対照サンプルとして、ステップ3.2で培養した細胞を0.5mlを14mlの丸底チューブに加えます。ステップ3.3の基質体積と同じ量のPBSを追加してください。
   4. 2つのサンプルを37°Cで200rpmで振って3時間キュベートします。
   5. その間に、FACSマシンはステップ2.3と同じ構成で準備してください。
   6. それぞれ1mlのPBSを含む5 mLの丸底チューブに、5μlの細胞(選別用)と対照細胞を加えます。
   7. 制御セルを含むチューブをFACSのロードポートに置き、FACSソフトウェアの取得ダッシュボードで「ロード」ボタンをクリックします。ダッシュボードのフローレートボタンを操作して、イベントレートを1,000〜3,000イベント/秒に調整できます。
   8. ソフトウェアのグローバルワークシートのDot Plotボタンをクリックして、対数スケールのFSC-A と 対数スケールのSSC-A散布図を作成し、ツールバーのPolygon Gateボタンを使って散布ゲートR1をシングレットイベント(細菌の集団)に調整します。
   9. ワークシートのドットプロットボタンをクリックして対数スケールのFSC-A と 対数スケールのFITC-A散布図を作成し、ツールバーのポリゴンゲートボタンを使ってプロット上のソートゲートR2を設定し、R2ゲート内で0.1%未満のネガティブセルを検出できるようにします。
   10. コントロールサンプルチューブをソーティングサンプルチューブに交換し、ダッシュボードのフローレートボタンでイベントレートを1,000〜3,000イベント/秒に調整してください。
   11. FACS機器の出口に0.5mlのLBを含む収集管を設置し、R1ゲートとR2ゲートの両方を満たす10個の⁴ セルを選別します。
       手記： ソート基準はR2ゲート内のFITC-Aの上位0.1%から5%の範囲です。このプロトコルでは、上位1%の細胞が陽性として収集されました。

Materials