遺伝子組み換え細菌細胞における標的酵素発現の検出

要約

出典: Kim, H. 他、 『高スループット遺伝子酵素スクリーニングシステムを使った多酵素スクリーニング』。 J. Vis. Exp. (2016年)

この動画では、メタゲノム的フォスミドライブラリーと染色基質を用いて酵素発現を検出する遺伝子スクリーニング法を示します。フローサイトメトリーは、着色生成物を生成する単一細胞を同定・分離し、活性酵素発現細胞の高スループット選択を可能にします。

プロトコル

1. p-ニトロフェノール(pNP)(pNP-GESS)検出のための遺伝子酵素スクリーニングシステムを用いたメタゲノムライブラリの準備
   1. フォスミドライブラリー生産キットを用いて、フォスミドベクターを用いて 大腸菌 のメタゲノムライブラリーを構築します。
   2. ライブラリーを−70°Cで保存するために100μlを別取りし、これはメタゲノムライブラリ細胞の供給源となります。
      手記： このライブラリストックの600 nm(OD₆₀₀)波長で測定された試料の光学密度は約100です。
   3. ストックメタゲノムライブラリー100 μlを氷で解凍し、500 mLのフラスコに接種します。そのフラスコには50 mLのルリア・ベルタニ(LB)と12.5 μg/mlのクロランフェニコールが含まれており、その後37°Cで2時間の培養を行います。
   4. 細胞を50mlの円錐形チューブで、1,000 x gで遠心分離し、4°Cで20分間採取します。
   5. ペレットを50mlの氷冷蒸留水(DW)に素早く再懸浮させ、1,000 x gで遠心分離機で再び4°Cで20分間加熱します。
   6. ペレットを10%(v/v)グリセロールを含む50μlの氷冷DWに再懸浮させます。このセルのアリコートを50μl使用して電気穿孔を行います。
   7. 電気適合細胞50μlとpGESS(E135K)DNA(100ng)の混合物を氷冷の電気孔孔キュベットに入れ、混合物を電気孔化(1.8 kV/cm、25 μF)します。
   8. カタボライト抑制(SOC)培地を素早く1mlの超最適なブロスに加え、細胞を優しく再懸浮させます。
   9. 細胞をピペットで14mlの丸底チューブに移し、37°Cで1時間培養します。
   10. 回収した細胞500μlを、クロランフェニコール12.5μg/mlとアンピシリン50μg/mlを含むLB(20×20cm)の正方形プレートに広げます。プレートを30°Cで12時間孵化します。
   11. 細胞スクレーパーでコロニーを削り取り、氷冷のセル保存培地で50mlの円錐形チューブに細胞を集めます。
   12. 遠心分離機で1,000 x gで4°Cで20分間加熱。ペレットを10mlの氷冷セル保存培地に再懸浮させ、OD₆₀₀ /100にします。
   13. −70°Cで保存用に20μlの細胞をアリコートします。
        
2. メタゲノムライブラリからの偽陽性の除去
   1. ステップ1.13のメタゲノムライブラリー細胞(メタゲノムDNAフォスミドとpGESS(E135K)を含むストックのメタゲノムライブラリー細胞を氷で解凍します。
   2. 細胞10μlを2mlLBに接種し、50μg/mlのアンピシリンと12.5μg/mlのクロランフェニコールを14mlの丸底チューブに接種します。37°Cで200rpmで振って4時間孵化します。
   3. その間に、蛍光活性化細胞選別機(FACS)を起動し、デフォルトのFACSソフトウェアを起動してください。以下の設定を使用してください:ノズル先端直径70μm;前方散乱面積(FSC-A)感度、300 V対数増幅;側散乱面積(SSC-A)感度、350 V対数増幅;フルオレセイン・イソチオシアネート面積感度(FITC-A)、450 V対数増幅;しきい値パラメータ、FSC-Aの値5。
      手記： 材料表に記載 されているFACS装置の典型的な設定が示されています。他のFACS機器の設定を調整してください。
   4. ステップ2.2のメタゲノムライブラリー細胞を希釈し、5μlのサンプルを1mlリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)入りの丸底チューブに加えます。
   5. 希釈したライブラリサンプルをFACS機器のロードポートに置き、FACSソフトウェアの取得ダッシュボードで「ロード」ボタンをクリックします。
   6. ダッシュボードのフローレートボタンをクリックしてコントロールすることで、イベントレートを1,000〜1,500イベント/秒に調整できます。
   7. ツールバーのDot Plotボタンをクリックして、グローバルワークシート上で 対数スケール のFSC-Aと対数スケールのSSC-A散布図を作成できます。ツールバーのポリゴンゲートボタンを使って、スキャッターゲートR1をシングルレットイベント(細菌の集団)を含み込むように調整します。
   8. ヒストグラムボタンをクリックして、ワークシート上でセル数 と 対数スケールのFITC-Aを区別したヒストグラムをプロットします。次に、検査制御ウィンドウのサイトメーター設定タブからFITC電圧を調整し、ベル型分布のピークがFITC-A^の 102倍未満になるようにします。
   9. 対数スケールのFSC-A を作成するグローバルワークシートのドットプロットボタンをクリックしてログFITCプロットを作成します。ツールバーのポリゴンゲートボタンを使ってプロット上にソートゲートR2を設定し、ゲートが分布の中心から+5%から-5%セル(ベル型曲線の頂点周辺の合計10%セル)に位置するようにします。
   10. FACS機器の出口に1.2 ml LBの50 μg/mlアンピシリンおよび12.5 μg/mlクロランフェニコールを含む採取チューブを置き、R1ゲートとR2ゲートの両方を満たす10個^の6 細胞を選別します。
   11. 集水チューブとキャップを外し、そっと渦を巻きます。
        
3. メタゲノム酵素スクリーニング
   1. ステップ2.11以降の選別セルを37°Cで200rpmで振ってOD₆₀₀ が0.5に達するまでキュベートします。
   2. 細胞内フォスミドのコピー数を増幅するために1μlのコピー誘導液を加えます。細胞を37°Cでさらに3時間、250rpmで振って培養します。
   3. 細胞の選別準備として、培養細胞0.5mlと適切な基質(p-ニトロフェニル酢酸塩、p-ニトロフェニルβ-D-セルロバイオシド、またはフェニルリン酸)を14mlの丸底チューブに最終濃度100μMで加えます。
      1. 対照サンプルとして、ステップ3.2で培養した細胞を0.5mlを14mlの丸底チューブに加えます。ステップ3.3の基質体積と同じ量のPBSを追加してください。
   4. 2つのサンプルを37°Cで200rpmで振って3時間キュベートします。
   5. その間に、FACSマシンはステップ2.3と同じ構成で準備してください。
   6. それぞれ1mlのPBSを含む5 mLの丸底チューブに、5μlの細胞(選別用)と対照細胞を加えます。
   7. 制御セルを含むチューブをFACSのロードポートに置き、FACSソフトウェアの取得ダッシュボードで「ロード」ボタンをクリックします。ダッシュボードのフローレートボタンを操作して、イベントレートを1,000〜3,000イベント/秒に調整できます。
   8. ソフトウェアのグローバルワークシートのDot Plotボタンをクリックして、対数スケールのFSC-A と 対数スケールのSSC-A散布図を作成し、ツールバーのPolygon Gateボタンを使って散布ゲートR1をシングレットイベント(細菌の集団)に調整します。
   9. ワークシートのドットプロットボタンをクリックして対数スケールのFSC-A と 対数スケールのFITC-A散布図を作成し、ツールバーのポリゴンゲートボタンを使ってプロット上のソートゲートR2を設定し、R2ゲート内で0.1%未満のネガティブセルを検出できるようにします。
   10. コントロールサンプルチューブをソーティングサンプルチューブに交換し、ダッシュボードのフローレートボタンでイベントレートを1,000〜3,000イベント/秒に調整してください。
   11. FACS機器の出口に0.5mlのLBを含む収集管を設置し、R1ゲートとR2ゲートの両方を満たす10個の⁴ セルを選別します。
       手記： ソート基準はR2ゲート内のFITC-Aの上位0.1%から5%の範囲です。このプロトコルでは、上位1%の細胞が陽性として収集されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コピーコントロール	震央	CCFOS110	Fosmidライブラリ生産キット
CopyControl誘導ソリューション	震央	CCIS125	フォスミドコピー誘導溶液
EPI300	震央	EC300110	電気能力セル
pCC1FOS	震央	CCFOS110	フォスミドベクター
遺伝子パルサーMxcell	バイオ・ラッド		電気孔孔キュベットおよび電気孔化システム
FACSAria III	ベクトン・ディキンソン		フローサイトメトリー(FACSマシン)
AZ100M	ニコン		顕微鏡
ウルトラスリム	マエストロゲン		LED照明器
50ml円錐管	BDファルコン
14ml丸底チューブ	BDファルコン
5ml丸底チューブ	BDファルコン
p-ニトロフェニルリン酸塩	シグマ・オルドリッチ	N7653	基板
p-ニトロフェニルβ-D-セロバイオサイド	シグマ・オルドリッチ	N5759	基板
p-ニトロフェニルブチルレート	シグマ・オルドリッチ	N9876	基板
ルリア・ベルターニ(LB)	BDディフコ	244620	トリプトン10 g/L、酵母抽出物 5 g/L、塩化ナトリウム 10 g/L
超最適スープ(SOB)	BDディフコ	244310	トリプトン 20 g/L、酵母抽出物 5 g/L、塩化ナトリウム 0.5 g/L、硫酸マグネシウム 2.4 g/L、塩化カリウム 186 mg/L
カタボライト抑制(SOC)を含む超最適なスープ		SOB、0.4%のグルコース
酵母抽出トリプトン2倍(2倍YT)	BDディフコ	244020	膵臓消化カゼイン16 g/L、酵母抽出物 10 g/L、酵母抽出物 5 g/L
セル保存媒体			YouTubeのスープ2つ、グリセロール15%、グルコース2%
pGESS(E135K)			dmpR、egfp遺伝子、適切なプロモーター、RBS、ターミネーターを含むDNAベクター。詳細は原稿の参考文献5を参照してください。
クロラムフェニコール	シグマ	C0378
アンピシリン	シグマ	A9518
BD FACSDiva	ベクトン・ディキンソン		フローサイトメトリーソフトウェア バージョン7.0
PBS	ギブコ	70011-044	0.8% NaCl、0.02% KCl、0.0144% ジナトリウムリン酸、0.024% 一カリウムリン酸、pH 7.4