in vitro ヒト腸内細菌叢による大腸内発酵を模倣するバッチカルチャーモデル

要約

出典: アフマディ、S. ら。介入療法がヒト糞便マイクロバイオータに与える影響を推定するためのin vitroバッチ培養モデル。 J. Vis. Exp. (2019年)。

このビデオは、厭気条件下で糞便サンプルを食物発酵性食物繊維で培養し、腸内細菌叢による代謝物産生を研究することで腸内微生物発酵をモデル化する方法を示しています。

プロトコル

サンプル採取に関わるすべての手続きは、研究所のIRBガイドラインに従って実施されています。

注意： 適切な物質安全データシートを参照し、適切なバイオセーフティレベル2(BSL-2)トレーニングの指示とガイドラインに従ってください。標準的なバイオセーフティ規則に従い、BSL-2キャビネットを使用し、無菌条件下で培養してください。さらに、異なるモデルやヒト被験者の糞便サンプルは微生物媒介性疾患の拡散リスクを抱える可能性があります。怪我や感染症があれば、すぐに医療機関を受診してください。さらに、ヒトおよび動物の便サンプルの使用は、機関の倫理委員会によって承認され、サンプルおよび被験者情報の使用に関するプロトコルに準拠しなければなりません。

1. 培養培地の準備

1. 培養培地の調合では、9種類のストック溶液を準備します。
   1. 溶液A(1,000 mL):塩化ナトリウム5.4g(NaCl)、二水素リン酸カリウム2.7g(KH₂PO₄)、塩化カルシウム二水和物0.16g(CaCl 2.2H₂O)、塩化マグネシウム六水和物0.12g(MgCl_{2.6H 2}O)、塩化マンガン4水和物0.06g(MnCl₂·4H₂O)、 脱イオン水中に0.06gのコバルト塩化六水和物(CoCl₂·6H₂O)と5.4gの硫酸アンモニウム(NH₄)2SO₄を加え、総体積を1,000 mLにします。
   2. 溶液B(1,000 mL):2.7 gのリン酸カリウム(K₂HPO₄)を脱イオン水に溶かし、総体積を1000 mLにします。
   3. 微量鉱物溶液(1,000 mL):ジナトリウムエチレンジアミン-テトラアセテート二水和物500 mg(Na₂EDTA)、硫酸鉄7水和物200 mg(FeSO 4.7H₂O)、硫酸亜鉛7水和物10 mg(ZnSO_{4.7H 2}O)、マンガン(II)塩化四水和物3 mg(MnCl₂·4H₂O)、リン酸30 mg(H₃PO₄)、 脱イオン水中で20 mgのCoCl_{2.6H 2}O、1 mgの塩化二水和物(CuCl 2.2H₂O)、2 mgの塩化ニッケル(II)六水和物(NiCl_{2.6H 2}O)、および3 mgのモリブデート二水和ナトリウム(Na₂MoO_{4.2H 2}O)を脱イオン水中で用い、総体積は1,000 mLにします。
      手記： この溶液は光に敏感なので、暗色または黒色またはアルミで包まれたチューブやボトルで保管してください。
   4. 水溶性ビタミン溶液(1,000 mL):脱イオン水にチアミン塩酸(チアミン塩酸)100mg、D-パントテン酸100mg、ナイアシン100mg、ピリドキシン100mg、P-アミノベンゾイン5mg、ビタミンB12 0.25 mgを脱イオン水に溶かし、合計1,000 mLにします。
   5. 葉酸:ビオチン溶液(1,000 mL):葉酸10mg、D-ビオチン2mg、炭酸水素アンモニウム100 mg(NH₄HCO₃)を脱イオン水に溶かし、合計体積を1,000 mLにします。
   6. リボフラビン溶液(1,000 mL):リボフラビン10 mgを5 mM HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸)(1.19 g/L)溶液に溶かし、合計体積を1,000 mLにします。
   7. ヘミン溶液(10 mL):ヘミン5,000 mgを10 mMの水酸化ナトリウム(NaOH)(0.4 g/L)溶液に溶かし、総体積を10 mLにします。
   8. 短鎖脂肪酸混合物(10 mL):N-バレレート2.5 mL、イソバレレート2.5 mL、イソブチル酸2.5 mL、DL-α-メチルブチル酸2.5 mLを組み合わせます。
      手記： この方法は、臭いや煙を避けるために排気フード内の使用が推奨されます。
   9. レサズリン(1,000 mL):1 gのレサズリンを脱イオン水に溶かし、総体積を1,000 mLにします。
2. 体外嫌気発酵に用いられる培地
   1. この培地を調製するには、溶液A330 mL、溶液B330 mL、微量ミネラル溶液10 mL、水溶性ビタミン液20 mL、葉酸(ビオチン溶液)5 mL、リボフラビン溶液 5 mLを混合します。ヘミン溶液2.5 mL、短鎖脂肪酸混合物 0.4 mL、レサズリン 1 mL、酵母抽出物 0.5g、炭酸ナトリウム(Na_2CO3)4 g、システインHCl-H₂O、トリプチカーゼ 0.5 g、蒸留水296.1 mLを加えます。
   2. pHをチェックして、7.0前後であることを確認しましょう。もしそうでなければ、1 N HClまたは1 N NaOHでpHを調整します。無菌作業台の下にボトルフィルターを設置して、培地を真空でろ過して滅菌します。
   3. あるいは、すべての成分(ビタミンとヘミン溶液を除く)を混ぜて121°Cで20分間オートクレーブし、室温まで冷やす方法もあります。同時に、0.22μmの膜フィルターを使ってビタミン液とヘミン溶液をろ過滅菌し、それらをオークレーブして冷却した培地に加えてからディスペンションします。

2. 嫌気性チャンバーおよび必要な材料の準備

1. 発酵実験に必要なすべての材料、溶液、道具は実験開始の少なくとも48時間前に嫌気チャンバー内に保管し、ツールやバッファー/溶液中の可溶性酸素の残留酸素が除去され、すべての材料が設定された嫌気条件に順応するようにしてください。
   手記： 嫌気性チャンバー内に必要な材料(実験開始から48時間前):(i) 発酵媒体;(ii)嫌気性溶液(第4.1節に従って調製)、(iii)ボルテクサー、(iv)計量天秤、(v)ムスリンチーズクロス、(vi)ハサミ、(vii)漏斗、(viii)1.5、2.0、15、50 mLチューブ、(ix)ピペット(2、20、200、1,000 μL)および対応ピペットチップ、(x)ガンピペットおよびピペット(5および10 mL)、(xi)紙ティッシュ、(xii)マーカー、(xiii)異なるチューブ用のチューブ、 (xiv) 廃棄物箱、(xv) 酸素指示器、(xvi) 70%エタノールスプレーボトル(消毒剤)。

3. チューブおよびファイバーの準備

1. イヌリン300mgを重量し、50mLのチューブに移し、その後、すでに準備して嫌気性チャンバーに保存していた26mLの発酵培地を無菌添加します。各糞便サンプルタイプと実験用チューブ(検査対象化合物の数に応じて)を3本ずつ準備します。
2. これらのチューブは嫌気性チャンバー内に約24時間置き、発酵実験を始める前にサンプルの水和を促します。接種時のチューブ温度を37°Cに保ち、チューブは嫌気性チャンバー内に閉じ込めたインキュベーター内に持ち込みます。

4. 接種剤の調製

1. 嫌気希釈溶液(発酵実験の少なくとも48時間前)を脱イオン水に溶かし、合計1,000 mLにします。オートクレーブ処理を行い、使用の少なくとも48時間前に嫌気性チャンバー内で保存してください。
2. 糞便接種物の調製(発酵実験当日):50 mLの円錐形チューブに新鮮な糞便サンプル5gを重くし、嫌気希釈溶液を加えて最終体積50 mL(1:10 w/v)にし、15分間または完全に均質化するまでボルテックスします。均質化された混合物を4層の滅菌チーズクロス(オートクレーブ)でろ過し、すぐに培地入りチューブで接種します。
   手記： 被験者群の糞便サンプルは、特定の化合物や成分が健康な糞便マイクロバイオータ全体と病変したものの比較を目的とする場合に統合できます。

5. 発酵とサンプリング

1. 4.2節に従ってチューブを準備し、4mLの希釈・ろ過済み糞便接種でブランク/コントロールチューブおよび実験チューブに接種してください。接種チューブは嫌気性チャンバー内で37°Cで培養します。チューブを1時間ごとに優しく逆さまに振って、繊維と接種剤を再び懸浮させてください。
2. 発酵中は、発酵中の2 mLのアリコートサンプルをそれぞれの発酵チューブから2 mLチューブに取り出し、必要に応じて1時間ごとから0、3、6、9、24時間ごとにサンプルを採取します。
3. 実験室用pHメーターを使ってアリコートのpHを測定します(pH電極を試料に直接挿入)。残りのサンプルを14,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。すぐに上清液とペレットを液体窒素で凍結し、スナップ冷凍後、SCFA(短鎖脂肪酸)分析のために上清液を保存し、マイクロバイオーム解析用に-80°Cでペレット保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
炭酸水素アンモニウム	シグマ・オルドリッチ	217255
硫安	TGI	C2388	毒性
二水和カルシウム塩化物	シグマ・オルドリッチ	C3306	もどかしい
コバルトス塩化六水和物	シグマ・オルドリッチ	255599
塩化銅二水和物	アクロス・オーガニックス	2063450000	有害でイライラさせる
システイン-HCl	シグマ・オルドリッチ	C121800
D-ビオチン	シグマ・オルドリッチ	B4501
D-パントテン酸	アルファ・アーサール	A16609
ジナトリウムエチレンジアミネテトラアセテート二水和物	バイオラッド	1610729
DL-α-メチルブチル酸	シグマ・オルドリッチ	W271918
硫酸鉄七水和物	シグマ・オルドリッチ	F8263	毒性
葉酸	アルファ・アーサール	J62937
グルコース	シグマ・オルドリッチ	G8270
ヘミン	シグマ・オルドリッチ	H9039
ヘペス	アルファ・アーサール	A14777
イソブチル酸	アルファ・アーサール	L04038
アイソバレーレート	アルファ・アーサール	A18642
塩化マグネシウム六水和物	シグマ・オルドリッチ	M8266
塩化マンガン・テトラハイドレート	シグマ・オルドリッチ	221279
ナイアシン(ニコチン酸)	シグマ・オルドリッチ	N4126
塩化ニッケル(II)六水和物	アルファ・アーサール	A14366	毒性
N-バレレート	シグマ・オルドリッチ	240370
P-アミノベンゾイン酸	中国議員	102569	有害でイライラさせる
燐酸	シグマ・オルドリッチ	P5811
リン酸二水素カリウム	シグマ・オルドリッチ	P5504
リン酸水素カリウム	シグマ・オルドリッチ	1551128
ピリドキシン	アルファ・アーサール	A12041
レサズリン	シグマ・オルドリッチ	R7017
リボフラビン	アルファ・アーサール	A11764
炭酸ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	1613757
塩化ナトリウム	フィッシャー・バイオリエージェント	7647-14-5
水酸化ナトリウム	フィッシャー・ケミカルズ	S320
モリブデート二水和ナトリウム	アクロス・オーガニックス	206375000
チアミン塩酸塩	アクロス・オーガニックス	148991000
トリプチカーゼ	BDバイオサイエンス	211921
ビタミンB12	シグマ・オルドリッチ	V2876
酵母抽出物	シグマ・オルドリッチ	70161
硫酸亜鉛七水和物	シグマ・オルドリッチ	Z0251
0.22μm膜フィルター
アンプア磁気精製ビーズ	アジャンクール
インキュベートーレ付きの嫌気性チャンバー	Forma 嫌気系、サーモ・サイエンティフィック、アメリカ
ボトルフィルター	コーニング
寒冷紗
pHメーター
渦動	熱科学的