Klebsiella pneumoniaeによる竹加水分解液の微好気発酵

要約

出典: Wei, D.ら 、 竹加水分解液を原料とした Klebsiella pneumoniae による化学物質の製造。 J. Vis. Exp. (2017年)

このビデオは、 Klebsiella pneumoniae を加水分解液ベースの培地で微好気性かつ軽度の酸性条件下で培養することで、竹由来の糖を2,3-ブタネジオールに微生物的に変換する方法を示しています。

プロトコル

1. 野生型肺炎(K. pneumoniae)による2,3-ブタンジオールの産生

1. 培地の調合には3Lの竹加水分解液を溶媒として使います。
2. 4 g/L のトウモロコシ蒸留酒、2 g/L(NH₄)₂SO₄、6 g/L K₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、0.2 g/L MgSO₄ を含む発酵培地を準備します。2.5 M NaOHを使って培地のpHを中性に調整します。発酵には3Lのオートクレーブ発酵培地を含む5リットルのバイオリアクターを使用します。
3. K . pneumoniae の細胞は-80°Cの低温冷蔵庫で保存してください。
4. 種子培養では、250mLのフラスコに50mLのルリア・ベルタニ(LB)培地を37°Cで一晩、200rpmで振るのを培養します。10 g/Lのトリプトン、5 g/Lの酵母抽出物、10 g/L NaClを含むLB培地を使用します。手記： 種子培養の細胞密度はOD2(600nmの光学密度)に達するべきです。
5. バイオリアクターで50mLの種子培養液を1フラスコに接種します。培養はpH6.0、37°Cで維持してください。空気の補助速度は2L/min、攪拌速度は250rpmで、微好気性状態を作り出します。
6. 発酵中は2時間ごとに5mLのサンプルを採取し、高圧液体クロマトグラフィーで分析してブロスの化学濃度を測定します。
7. バイオリアクターに添加されたアルカリを微生物燃料電池システム/データ取得(MFCS/DA)を用いてオンラインで監視します。
   手記： 発酵過程で有機酸が生成され、培養のpHを安定させるためにNaOHが添加されます。添加されたアルカリの体積は生成される酸の量を表します。アルカリ添加線が停滞すると、炭素源の枯渇か細胞死のいずれかによりプロセスは終了します。

2. K. pneumoniaeのbudC変異体によるR-アセトイン産生

1. アセトイン製造用の培地を準備します。4 g/Lのトウモロコシ抽出液、2 g/L(NH₄)、₂g/L 酢酸ナトリウム 3 g/L、0.4 g/L KCl、0.1 g/L MgSO₄ です。
2. R-アセトインの生成にはK. pneumoniae-ΔbudCを使用してください。ステップ1.4-1.5を繰り返します。
   注:budCは2,3-ブタネジオール脱水素酵素をコードしています。K. pneumoniae-ΔbudCは2,3-ブタネジオール脱水素酵素活性を失い、2,3-ブタネジオールの代わりにR-アセトインを産生します。
3. 培養はpH6.0、37°Cに維持してください。空気補助率4L/min、攪拌速度450rpm、好気性条件を用いてください。
   手記： 酸素補給量は2,3-ブタネジオールの生産よりも多いです。
4. ステップ1.6のようにサンプルを分析します。

3. K. pneumoniaeのbudA変異体による2-ケトグルコン酸産生

1. 2-ケトグルコン酸の製造には、 R-アセトイン製造と同じ培地を使用します。
2. 2-ケトグルコン酸の生成には K. pneumoniae-ΔbudA を使用します。ステップ1.4-1.5を繰り返します。
   注:budAはα-アセトアクチート脱カルボキシラーゼをコードします。K. pneumoniae-ΔbudAはα-アセトアクタ酸脱カルボキシラーゼ活性を失い、グルコースを基質として2-ケトグルコン酸を産生します。
   注: 2-ケトグルコン酸合成は酸性条件依存のプロセスです。2段階の発酵法は2-ケトグルコン酸生成のために開発されています。第一段階では、種子培養物をバイオリアクターに接種します。
3. 培養はpH 7.0、37°Cに保ちます。空気補助速度は4L/min、攪拌速度は500 rpmにしてください。
   手記： これらの条件下では細胞は非常に速く増殖し(細胞密度は約4時間でOD7に達します)、その後、発酵は第2段階に進み、培養pHは5.0まで低下します。酸は加えられません。培養で生成される有機酸は自然にpHを低下させます。これらの酸性条件下では細胞の成長は止まりますが、2-ケトグルコン酸が合成され、スープ中に蓄積されます。
4. ステップ1.6のようにサンプルを分析します。竹の加水分解液を炭素源として使う。
   手記： 培地中のグルコースは2-ケトグルコン酸に変換され、キシロースはキシロン酸に変換されます。したがって、2-ケトグルコン酸とキシロン酸の混合物が得られます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
オートクレーブ	三洋	3780
バイオリアクター	サルトリウス・ステディム・バイオテクノロジー	ボスタット・アプラス
扇動者	イカ	RW 20
高性能液体クロマトグラフシステム	島津商社	20AVP
竹粉	中国浙江省から購入		メッシュ番号、50
セルラーゼ	生化学、山東、中国に伝えてくれ		200 PFU/mL