S. aureusの代謝物を分析するための液体クロマトグラフィー–質量分析法に基づくアプローチ

要約

出典: サミュエルズ、D. J.、 他 黄色 ブドウ球菌の代謝物分析におけるタンデム液体クロマトグラフィー–質量分析法アプローチ。 J. Vis. Exp. (2017年)

このビデオでは、S . aureusの細胞内代謝物を同定・定量するために液体クロマトグラフィー質量分析法を用いる方法を示しています。代謝物抽出、ペプチド正規化、液体クロマトグラフィー、質量分析の各段階を概説しています。

プロトコル

1. 代謝物抽出

1. 湿氷上で解凍サンプルを取り、均質化装置で6,000rpmで4回の30秒バーストを行い、サイクル間にはドライアイス上で2分間の冷却期間があります。
2. 溶解液を、事前に冷却された冷蔵マイクロ遠心分離機で最大速度(すなわ ち18,213 x g、≤4 °C)で15分間清算します。
3. 上清液をきれいなマイクロ遠心分離機チューブに移します。
4. マイクロピペットを用いて、サンプルの一部をマイクロ遠心分離機管に移し、ステップ2で残留ペプチド含有量の定量を行います。残りは-80°Cで保存します。
   手記： 保存サンプルの体積は、ステップ2.1で使用されるビシンコニン酸(BCA)アッセイによって異なります。このサンプルは即時分析のために湿った氷の上に保管するか、-80°Cで凍結する必要があります。

2. ビシンコニン酸(BCA)アッセイ

1. キットメーカーの推奨に従い、ステップ1.4のサンプルを用いて各サンプルの残留ペプチド濃度を決定し、BCAアッセイを実施します。

3. 液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)

1. 75μLの 黄色ブドウ球 菌(S. aureus) 抽出物と75μLのLC-MS溶媒Bを1.4段階で調製します。
2. 渦を混ぜて13,000 x gで5分間回転させてください。
3. 100μLの上清液を液体クロマトグラフィー(LC)バイアルに入れ、キャップをします。試料内に気泡が閉じ込められていないか確認してください。
4. LCバイアルをLC-MSオートサンプラーに読み込み、ソフトウェア「Offline Worklist Editor」で実行リストを編集します。
   1. 「サンプル名」(例 :野生型1)、「サンプル位置」(例 :P1-A1)、「方法」(例 :蟻酸陰性法)、「データファイル」(例 :野生型1)の列を記入してください。「ワークリストを保存」ボタンをクリックしてください。「質量分析データ取得ワークステーション」ソフトウェアを開き、以前に保存したワークリストを入力してください。「ワークリスト実行開始」ボタンをクリックすると、連続LC-MS測定を開始します。
5. 試料をカラム上で分離し、そのカラムを飛行時(TOF)分光器に接続し、TOF分光器とLCシステムを結合させます。移動相勾配を以下のように用いてください:0-2分、溶媒B85%;3〜5分、溶媒B80%;6〜7分、溶媒B75%;8〜9分、溶媒B70%;10〜11.1分、溶媒B50%;11.1〜14分、溶媒B20%;14.1〜24分、溶媒B5%;最後には85%溶媒B、流量0.4 mL ^min-1で10分間の再平衡期間を経ます。
6. アイソクラティックポンプを使い、基準質量溶液をランに注入し、同時質量軸の校正を可能にします。
   手記： このステップは標準のTOF分光計マニュアルに基づいています。
   1. 酢酸D4とヘキサキス(1H,1H,3H-テトラフルオロプロポキシ)ホスファジンの混合物を基準質量溶液として用い、リアルタイムの校正を行います。注入^には流量 2.5 mLのアイソクラティックポンプを使用してください。

4. イオンカウントのバッチ補正

1. バッチ補正の基準サンプルとして任意のサンプルを指定します(例: 野生型、複製1)。
2. 参照試料内のすべての代謝物のイオンカウントの合計を計算します。この計算をすべてのサンプルで繰り返します。
3. 各サンプルの総イオンカウントを基準サンプルの総イオンカウントで割って比率を算出します。
4. 試料内の各代謝物のイオンカウントをサンプル/基準比で割ることで、各代謝物のバッチ補正イオンカウントが得られます。

5. ペプチド正規化

1. ステップ4で得られた各サンプルのバッチ補正イオンカウント値を、ステップ2のBCAアッセイで決定したペプチド濃度で割り、各代謝物の正規化値を得ます。
   手記： ステップ5.1で得られた各代謝物の正規化・バッチ補正イオンカウントは、株間で直接比較でき、統計解析(例: マン・ホイット ニーU検定)にかけることができます。あるいは、処理や遺伝的背景によって変化がないことが知られている代謝物を正規化器として用いて代謝物分解による変化を検出することもあります。抽出バッファーに既知の量のL-ノルバリンまたはグルタル酸を含めることで、試料処理中の損失補正に利用できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
素材/装備
耐衝撃チューブ、2 mL	USAサイエンティフィック	1420-9600
シリカビーズ、0.1 mm	バイオスペック・プロダクツ株式会社	11079101Z
Precellys 24ホモジナイザー	ベルタン・インストゥルメンツ	EQ03119-200-RD000.0
マイクロBCAタンパク質アッセイキット	ピアース(サーモ・サイエンティフィック)	23235
コジェントダイヤモンド水素化水素C型カラム	アジレント	70000-15P-2
高精度質量飛行時間(TOF)LC-MS、6200シリーズ	アジレント	G6230B
クワットポンプ、1290シリーズ	アジレント	G4204A
ビンポンプ、1290シリーズ	アジレント	G4220A
バルブドライブ、1290シリーズ	アジレント	G1107A
アイソクラティックポンプ、1290シリーズ	アジレント	G1310B
TCC、1290シリーズ	アジレント	G1316C
サンプラー、1290シリーズ	アジレント	G4226A
サーモスタット、1290シリーズ	アジレント	G1330B
ケミカル
リン酸緩衝塩水(pH 7.4)10倍	アンビオン	AM9624	新鮮なものを超純水で1倍に薄めます
アセトニ トリル	フィッシャー・サイエンティフィック	A955-500	オプティマLC-MS
蟻酸	シグマ・オルドリッチ	94318	質量分析では98%です
マスハンター	アジレント	G3337AA
細菌株	種	濾す	遺伝子型
SRB 337	黄色 ブドウ 球菌	USA200 MSSA UAMS-1	野生型
SRB 372	黄色 ブドウ 球菌	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm