自動マイクロバイオリアクターを用いた異なる培地製剤における細菌増殖のモニタリング

要約

出典:ヘメリッヒ、J.ら。自動マイクロバイオリアクター技術を用いた異質タンパク質生産の最適化プロトコル。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオは、異なる培地配合に応じて細菌の増殖や蛍光タンパク質分泌を監視するために自動化マイクロバイオリアクターを用いる方法を示しています。分泌性蛍光タンパク質を発現する遺伝子組換え細菌は抗生物質選択下で培養され、栄養素多様性のあるウェルに接種されます。細胞密度と蛍光のリアルタイム光学測定により、異なる成長条件下でのタンパク質産生の比較解析が可能になります。

プロトコル

1. 材料の準備および定義手続き
手記： 実験手法を詳細に定義し、固定することが推奨されます。この標準化により、異なる結果が生物学的変異性や培地組成の違いにまで遡ることが保証されます。​
手記： メディアストックソリューション:調査対象のメディア成分ごとに個別のストックソリューションを準備します。すべての成分で異なる体積を希釈できるように、高濃度のストックを準備します。これは、設計計画に従ってすべてのストック溶液を最大体積で組み合わせた後、最終培養量を超えてはならないことを意味します。 参照 :「中ストック溶液ピペッティングリストの生成」ステップ1.3.3参照。高濃度溶液を加えた結果、最終培養量の1/100 <ほど の添加量が減る場合は、それに応じてストック溶液を希釈します。例えば、本研究ではピペッティング容量が10 μL未満は実現不可能と定義されました。通常、微量元素溶液は媒質中の最終標準濃度に対して最大1,000倍まで濃縮されます。リファレンスレシピでは、メディア成分を濃度に対して倍数(Xフォールド)で濃縮するのが有利です。これにより、分数小数の非現実的なピペッティングボリュームを回避できます。CgXII培地のすべてのストック溶液の詳細なレシピは補足文書に記載されています。

1. 作業セルバンク(WCB)
注:各成長実験ごとに1つのWCBアリコートが使用されます。さらにアリクオートが必要な場合は、100 mLの脳心臓注入(BHI)培地を1,000 mLのバッフルシェイクフラスコに使用するか、複数のシェイクフラスコを接種し、グリセロール溶液を加える前にそれらをプールします。

1. 組換え発現株 C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP43の単一コロニーを寒天プレート(37 g/L BHI粉末、20 g/L 寒天、25 mg/L カナマイシン)に製製します。メッティング素材は新鮮な変質から得られるか、クライオ保存されたアリコットから得られます。30°Cで抱卵し、単一の群れが現れるまで行う。通常、これには1〜2日かかります。
2. シェイカーフラスコ培養(50 mL BHI培地に25 mg/Lカナマイシン、500 mLバッフルフラスコ、250 rpm、シェイキング直径25 mm、30°C)にコロニー素材を接種し、約16時間(一晩)培養します。
3. 得られた細胞懸濁液の1体と500 g/Lの滅菌グリセロール溶液1体を混ぜ、2 mLのアリコートで滅菌凍結保存バイアルに分散します。-80°Cで保存します。

2. MBR培養プロトコル
手記： 本研究で用いられたBioLector MBRシステムでは、散乱光(バイオマス)およびGFP蛍光が強度測定であり、一定の利得値が割り当てられます。利得が高いほど、光信号は増幅されます。これが散乱光や蛍光が任意の単位(A.U.)で測定される理由でもあります。予備実験におけるバイオマスおよびGFP検出に適した利得値を決定するとともに、後期プロセスで高濃度バイオマス濃度での酸素制限を避けるための適切な振動頻度と充填容積を決定します。採用された栽培条件(「フラワープレート」、 すなわち花形型の48井戸MTP、振動周波数1,200rpm、充填体積1,000μL、主炭素源10g/Lグルコース)により、酸素無制限の栽培が保証されました。花型48ウェルMTPにおける充填容積や振動周波数の他の組み合わせによる最大酸素輸送率については、供給元からデータシートが利用可能です。また、個々の培養物の成長欠陥は二次基質(例:窒素、微量元素)の不足によって起こることがあります。したがって、栽培終了時のバイオマス濃度を確認してください。本研究ではそのような成長効果は観察されませんでした。

1. MBRシステム(「BioLector」)の培養プロトコルを次のように定義します。
2. フィルターセット1:バイオマス、ゲイン14。フィルターセット2:pH、ゲインはプリセットです。フィルターセット3:pO2、ゲインはプリセット済みです。4:GFP、80ゲイン。
3. 振動周波数:1,200 rpm。
4. 温度:30°C。
5. サイクルタイム:15分。
6. 実験時間:手動(栽培は自動的に停止されません)。

3. 中ストック溶液ピペッティングリストの作成
手記： ほぼすべての液体取り扱いロボットシステムは、外部ファイルからピペッティング動作を読み取ることができます。基本的に必要な最小情報は、試薬源の転送容積と位置、そしてそれぞれの目的地をロボットデッキ上のラボウェアの位置とラボウェア内の特定のキャビティで表します。しかし、異なる液体取り扱いシステムごとに異なる構文を考慮する必要があります。 図1 は、本研究で使用されたピペッティングシステムの例ファイル構造を示しています。

1. 各培養井戸にピペットで注入される4種類のストック溶液:

1. 多様な媒体成分のストック溶液(「バリエーションストック」)。
2. 上記のストックの累積体積の違いを補うために水を供給します。
3. 固定されたすべての部品を含むストックソリューション(「レストストック」)です。このストック溶液は、異なる温度で保存されたり、異なる滅菌方法で処理された成分を含むストックから構成されることがあります。
4. 接種剤は最後の成分として加え、添加直前に作業台に置くことで細胞の沈降を防ぎます。

2. 培養井戸ごとに、すべての媒体成分で移送する体積を以下に従って計算します。

特定のバリエーションストックで追加されるボリュームは、この特定の成分が省略された場合にゼロになることもあります。

3. 計算されたすべての体積Viを適切な 数値に修正 する。ピペットの体積の段階での増量はあまり小さくあってはいけません。必要に応じて、 バリエーションストックの濃度を調整してください。例えば、ここでの最小ピペッティング容積は10μL、最小増分は5μLと定義されました。一般的に、これらの体積は、使用される液体取扱ステーションの実験的に測定された精度と精度に基づいて定義されるべきです。

4. すべての井戸の固定成分を含む 残存 量の体積を次のように計算します。

ここで、 バリエーションストック の最大累積ボリュームが用いられます。したがって、 レストストック 内の固定成分の必要な濃度を次のように計算します。

それに応じてレストストックを準備してください。

5. 耕作井戸ごとに加える水の量を次のように計算します:

6. 培養井戸ごとに、追加予定のすべての体積を以下の順に記載します: V_H2O、V_RestStock、V_i、V_Inok。図 1に示すように、液体処理ステーションの仕様に従ってピペッティングリストをフォーマットします。

2. 種子培養、自動培地準備、主培養の開始

1. 液体処理ロボット用のプロトコルを作成しましょう。図 2 および 図3 は、対応する「WinPREP」ソフトウェアで実装された「Janus」システムのプロトコル例をご覧ください。プロトコルは以下の側面を考慮すべきです。

1. 培地準備前に十分な無菌ハウジングの稼働時間を含めること。

2. ピペッティングの先端やチューブの初期の過剰な清掃と洗浄を含めること。

3. ストック溶液に適した実験器具の容器を選ぶこと。ここでは、12本の柱を持つ深いウェル板が バリエーションストックの保管に適しています。なぜなら、8本のピペッティングチップすべてが並行してウェルの柱に浸入できるからです。これによりメディア準備が大幅に速くなります。15 mLまたは50 mLの試薬チューブをリザーバーとして使用する場合、一度に浸すのは1つのピペッティングチップのみです。水や レストストックなど他のストックでは、100mLのトラフが使用されます。これらのストック溶液は総容量が多いためです。

4. 廃棄物量やピペッティングの高さ、オフセットなどを補正するために、各ストック溶液に対して十分な総体積を提供すること 。

5. 接種ステップの前にユーザープロンプトを挿入し、このステップが種子培養手順の直前に実施されるようにします。

2. すべてのストック溶液は滅菌状態で準備し、適切な容器( 例:滅菌15 mLおよび50 mL試験管)で使用まで保存してください。
3. 作業台上のストック溶液保存のために、70%エタノールで拭き取ってから層流フードで乾燥させるなど、深い井戸板を滅菌します。
4. 種子培養は、WCBから1つのアリコートを含んだ25 mg/Lのカナマイシンを含む50 mLのBHI培地に接種することから始めます。MBR培養前に、指数関数的に成長する種子培養から新鮮で重要な接種物を十分な量で準備してください。
5. 必要な実験器具をすべてロボット作業台に置き、対応する実験器具にストック溶液を注ぎます。
6. 培地準備のためのロボットワークフローを開始し、最終段階(接種)が種子培養開始と間に合うようにします。ロボットワークフローの総稼働時間は事前に評価する必要があります。本作の総上映時間は約1.5時間でした。
7. 種子培養は約2時間後に採取し、その後1時間ごとに採取し、光学密度(OD₆₀₀)で成長を監視します。約5時間後、培養液は3〜4 OD₆₀₀ に達し、主要な培養菌への接種に使用されます。
8. 種子培養を液体ハンドラーの作業台に置き、培地準備手順を継続します。接種後のアザラシ栽培MTP。
9. 密封された培養MTPをBioLectorデバイスに入れ、あらかじめ定められた培養プロトコルを開始します。
10. 必要に応じてバイオセーフティ規則に従い、残ったストック溶液を処分し、ロボット作業台から培養物をまきまく。再利用可能な実験器具を清掃し、液体ハンドラーの除染プロトコルを開始してください。

結果

図1:感度解析用の体積ピペッティングリストからのスクリーンショット。最初の列のエントリは、行のすべてのボリュームに一意識別子を割り当てます。この識別子は液体ハンドラー作業台上のターゲット栽培MTPのMTP井戸番号であり、図3C参照。残りのカラムは、ピペット化する異なる溶液(「Sln-01」から「Sln-15」)の体積をエンコードします。1列の累積体積は対応する井戸の最終耕作量に相当します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バイオレクター	M2P-Labs	G-BL-100
フラワープレート	M2P-Labs	MTP-48-BOH	バイオレクター装置での培養用
シール箔	M2P-Labs	F-GP-10	フラワープレートの滅菌シール
MATLAB	数学作品	2016b
クリキット	Forschungszentrum Jülich	該当なし	無料で入手可能で、MATLABのインストールが必要です
ヤヌスピペッティングロボット	パーキン・エルマー	該当なし	「WinPrep」ソフトウェアのインストールが含まれています
12カラム深井戸マイクロプレート	E&Kサイエンティフィック	EK-2034	中ストック溶液用の容器
C. グルタミクム pCGPhoDBs-GFP	該当なし	該当なし	b.subtilisのGFP遺伝子とPhoDシグナルペプチドの融合を発現挿入として携行するpEKEx2プラスミド。プラスミドはカナマイシン耐性を提供します。Meissnerらによる記述および発表。Appl Microbiol Biotechnol 76巻3号、633–42頁(2007年)