出典: Lea-Smith, D. J. ほかモデルシアノバクテリア種におけるマーキングおよびマーカーレス変異体の生成。 J. Vis. Exp. (2016年)
このビデオは、濃縮細胞懸濁液をグリセロールまたはDMSOと組み合わせて低温で保存することでシアノバクテリア株の低温保存を示し、光合成や遺伝学研究のための生存可能な培養物の長期維持を可能にします。
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方法論記事
グリセロールまたはジメチル硫酸を用いたシアノバクテリア株の長期凍結保存
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2025年11月28日
この記事について
要約
プロトコル
1. 培養培地の準備
- BG11メディアを準備する
- BG11、微量元素、鉄剤100倍のストック溶液を準備します(表1)。
- リン酸塩ストック、炭酸ナトリウム(Na2CO3)、ストックN-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-2-アミノエタンスルホン酸(TES)バッファー、および重曹炭酸ナトリウム(NaHCO3)を別々に溶液で準備します(表1)。
- リン酸塩とナスカイナ2CO3のストックをオートクレーブ処理します。0.2μmフィルターでTESバッファーとNaHCO3をフィルター滅菌します。
- BG11は、水976ml、100x BG11を10ml、微量元素1ml、鉄ストック1mlを混ぜて溶液をオートクレーブ処理します。この溶液が室温まで冷めた後、リン酸塩ストック1ml、Na2CO3ストック1ml、NaHCO3 10mlを加えます。
- BG11固形培地の場合は、フラスコ1つに15gの寒天と700mlの水を加えます。2つ目のフラスコにチオ硫酸ナトリウム3g(Na2S2O3)、水226ml、100x BG11 10ml、微量元素1ml、鉄ストック1mlを加えます。両方の溶液をオートクレーブで消毒してください。これらの溶液が室温まで冷めたら、リン酸塩ストック1ml、Na2CO3ストック1ml、TESバッファー10ml、NaHCO3 10mlを加えます。
手記： 特定の塩分の沈殿を避けるために、溶液は別々に調合されます。
- ショ糖の選別には、50%(w/v)のショ糖溶液を準備します。0.2μmのフィルターで溶液を滅菌し、BG11(50%ショ糖100mlからBG11の900ml)を加えてBG11/5%ショ糖プレートを作ります。
手記：NaHCO3はBG11/5%ショ糖寒天プレートに添加しないでください。通常通りNa2CO3を追加してください。 - シネココッカスの培養には、10mlの1M4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N′-(2-エタンスルホン酸)(HEPES)、およびビタミンB12111 1 mLを加えます(表1)。
手記： 市販のBG11培地で培養された株の形換えは、ここで説明するBG11培地レシピに比べて効率が著しく劣るため、推奨されません。
2. 品種の長期貯蔵
- 細胞を30〜50mlのBG11培地に接種して、菌株の新しい培養をセットアップします。培養を3〜4日間、OD750nm = 0.4から0.7まで培養します。
- BG11でセルを一度洗浄し、約2mlのBG11に再懸浮します。
- 1本のチューブに0.8mlの濃縮細胞を加えます。次に、80%フィルターで滅菌したグリセロールを0.2ml加えます。
- オプション:別のチューブに0.93mlの濃縮細胞を加える。このチューブにDMSOを0.07ml加えます。
注意： DMSOは有害であり、適切な保護のもとで取り扱うべきです。 - 両方のチューブは-80°Cで保存してください。株を復活させるには、チューブを外し、鈍い爪楊枝でいくつかの細胞を抗生物質なしで寒天プレートにこそげ落とします。無菌ループで通常通りストリークを出してください。
表1:本研究で用いられた解決策
| ストック溶液のレシピ | |
| ケミカル | 金額(g) |
| BG11 100倍(Lあたり) | |
| NaNO3 | 149.6 |
| MgSO4.7H 2O | 7.49 |
| CaCl2.2H 2O | 3.6 |
| クエン酸 | 0.6 |
| 1.12mlを加えて0.25M、Na2EDTA、pH 8.0 | |
| 0.25 M Na2EDTA、pH 8.0(100 mlあたり) | |
| Na2EDTA | 9.3 |
| 微量元素(100mlあたり) | |
| H3BO3 | 0.286 |
| MnCl2.4H 2O | 0.181 |
| ZnSO4.7H 2O | 0.022 |
| Na2MoO4.2H 2O | 0.039 |
| CuSO4.5H 2O | 0.008 |
| Co(NO3)2.6H 2O | 0.005 |
| 鉄のストック(100mlあたり) | |
| フェリックアンモニウムシエントレート | 1.11 |
| リン酸塩ストック(100mlあたり) | |
| K2HPO4 | 3.05 |
| ナッタ2、CO3 (100mlあたり) | |
| NA2CO3 | 2 |
| TESバッファー、pH 8.2(100 mlあたり) | |
| TES | 22.9 |
| NaHCOストック3 (100mlあたり) | |
| NaHCO3 | 8.4 |
| HEPES、pH 8.2(500 mlあたり) | |
| ヘペス | 119.15 |
| ビタミンB12(50mlあたり) | |
| シアノコバラミン | 0.02 |
| ルリア・ベルターニ・メディア(500mlあたり) | |
| ルリア・ベルターニのスープ | 12.5 |
| 1 M MgCl2 (100 mlあたり) | |
| MgCl2.6H 2O | 20.33 |
| 溶液A(200mlあたり) | |
| MnCl2.4H 2O | 0.395 |
| CaCl2.2H 2O | 1.47 |
| 2-(N-モルフォリノ)エタンスルフォン酸水和物、4-モルフォリンエスタンスルホン酸(MES) | 0.4265 |
| 溶液A+グリセロール | |
| 10ml溶液A | |
| グリセロール1.5mlです | |
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| NaNO₃ | シグマ | S5506 | |
| MgSO₄·7H₂O | シグマ | 230391 | |
| CaCl₂ | シグマ | C1016 | |
| クエン酸 | シグマ | C0759 | |
| Na₂EDTA | 漁夫 | EDT002 | |
| H₃BO₃ | シグマ | 339067 | |
| MnCl₂·4H₂O | シグマ | M3634 | |
| ZnSO₄·7H₂O | シグマ | Z4750 | |
| Na₂MoO₄·2H₂O | シグマ | 331058 | |
| CuSO₄·5H₂O | シグマ | 209198 | |
| Co(NO₃)₂·6H₂O | シグマ | 239267 | |
| フェリックアンモニウムシエントレート | シグマ | F5879 | |
| K₂HPO | シグマ | P3786 | |
| Na₂CO₃ | 漁夫 | SODC001 | |
| TES | シグマ | T1375 | |
| NaHCO₃ | 漁夫 | SODH001 | |
| ヘペス | シグマ | H3375 | |
| シアノコバラミン | シグマ | 47869 | |
| Na₂S₂O₃ | シグマ | 72049 | |
| バクト寒天 | BD | 214010 | |
| 蔗糖 | 漁夫 | SUC001 | |
| ペトリ皿 90mm トリプルベント | グライナー | 633185 | |
| 0.2μmフィルター | サルトリウス | 16534 | |
| 100ml円錐形フラスコ | パイレックス | CON004 | |
| パラフィルムM 100mm x 38m | ベミス | FIL003 | |
| フュージョン高忠実度DNAポリメラーゼ | フュージョン | F-530 | |
| アガロース | メルフォード | MB1200 | |
| DNA精製キット | モビオ | 12100-300 | |
| 制限性エンドニュークレアーゼ | NEB | ||
| T4リガーゼ | サーモ・サイエンティフィック | EL0011 | |
| ルリア・ベルターニのスープ | インビトロジェン | 12795-027 | |
| MES | シグマ | M8250 | |
| カナマイシン硫酸塩 | シグマ | 60615 | |
| アンピシリン | シグマ | A9518 | |
| GeneJETプラスミドミニプレップキット | サーモ・サイエンティフィック | K0503 | |
| 14ml丸底チューブ | BDファルコン | 352059 | |
| GoTaq G2 フレキシDNAポリメラーゼ | プロメガ | M7805 | |
| 425-600μmのガラスビーズ | シグマ | G8772 | |
| グリセロール | シグマ | G5516 | |
| DMSO | シグマ | D8418 | |
| 蛍光灯 | グロラックス | 69 | |
| HTマルチトロンフォトバイオリアクター | インフォラーズ |
