マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

サマリー

アッセイは、細菌および真菌の早期のバイオフィルム形成を測定する迅速な手段を説明します。このメソッドは、微生物のバイオフィルム形成のための基層としてのマイクロタイタープレートを使用し、バイオフィルムは、クリスタルバイオレットの菌株を用いて可視化です。アッセイは、どちらかの初期のバイオフィルム形成のための定性的または定量的なアッセイを提供する。

要約

バイオフィルムは、医療、産業および自然な設定で見つけることができる表面に付着した微生物のコミュニティです。実際には、バイオフィルムでの生活は、おそらくほとんどの環境での微生物の成長の支配的なモードを表します。成熟したバイオフィルムは、いくつかの異なった特徴を持っている。バイオフィルムの微生物は、通常、地域社会への構造と保護を提供する細胞外マトリックスに囲まれています。バイオフィルムで成長している微生物はまた、一般的に液体で満たされたチャンネルに囲まれたmacrocolonies（細胞の数千を含む）で構成される特徴的なアーキテクチャを持っている。バイオフィルム成長微生物はまた、臨床的に適切な抗生物質を含む抗菌薬の範囲への抵抗性は周知の事実です。

マイクロタイター皿のアッセイは、バイオフィルム形成の初期段階の研究のための重要なツールであり、このアッセイはまた、真菌バイオフィルム形成を研究するために使用されているが、細菌のバイオフィルムの研究のために主に適用されています。このアッセイは、静的、バッチ成長の条件を使用しているので、それは通常、フローセルシステムに関連付けられている成熟したバイオフィルムの形成のために許可されていません。しかし、このアッセイは、バイオフィルム形成の開始に必要な多くの因子を同定するのに有効であった（す​​なわち、鞭毛、繊毛、アドヘシン、サイクリック - ジ - GMPの結合や代謝に関与する酵素）と同様に細胞外多糖の生産に関与する遺伝子いる。さらに、出版された仕事は、マイクロタイター皿で増殖したバイオフィルムは、免疫系のエフェクターのような抗生物質耐性と耐性を成熟バイオフィルムのいくつかのプロパティを開発しないことを示します。

このシンプルなマイクロタイター皿のアッセイは、壁および/またはマイクロタイター皿の底部にバイオフィルムを形成することができます。アッセイのハイスループットな性質は、遺伝子スクリーニングだけでなく、様々な成長条件の下で、複数の菌株によってバイオフィルム形成のテストに役立ちます。このアッセイの亜種がこれに限定されないが、シュードモナス、 コレラ菌 、 大腸菌、staphylocci、腸球菌 、 マイコバクテリアおよび真菌を含む微生物の様々な、のために初期のバイオフィルム形成を評価するために使用されています。

プロトコルここで説明するには、我々はモデル生物、緑膿菌によるバイオフィルム形成を研究するために、このアッセイの使用に焦点を当てます。このアッセイでは、バイオフィルム形成の程度は、染料クリスタルバイオレット（CV）を用いて測定されます。しかし、他の比色及び代謝汚れの数は、マイクロタイタープレートアッセイを用いてバイオフィルム形成の定量化のために報告されている。マイクロタイタープレートアッセイの容易さ、低コストと柔軟性がバイオフィルムの研究のための重要なツールきました。

プロトコル

1。バイオフィルムの成長

1. 野生型の緑膿菌や豊富な培地で一晩変異株（すなわち、LB）の文化を育てる
2. バイオアッセイのための新鮮な培地に一晩培養1:100に希釈する。 Pの標準的なバイオアッセイ培地緑膿菌は、硫酸マグネシウム、グルコースとカザミノ酸（表を参照）を添加したM63最少培地です。小さいプランクトンの成長と、より強固なバイオフィルムを刺激する媒体を代替の促進バイオフィルムとして、グルコースとカザミノ酸を唯一の炭素およびエネルギー源としてのアルギニンに置き換えることができます。
3. 96ウェルディッシュに1ウェルあたり希釈液100μLを加える。定量的なアッセイでは、我々は通常、それぞれの治療のために井戸を複製4-8使用。
4. 37 4から24時間のためのマイクロタイタープレートをインキュベート℃に

2。バイオフィルムを染色

1. インキュベーション後、プレートを裏返して液体を振とうして細胞をダンプする。
2. 水の小さな浴槽に静かに沈めるプレート（すなわち、浴槽などのP1000 pipetmen用ピペットチップボックスの底部を使用）。水を払います。このプロセスをもう一度繰り返します。この手順は、次のステップで染色することができますアタッチされていない細胞と培地成分を除去する手助けを、と大幅にバックグラウンド染色を低減します。
3. マイクロタイタープレートの各ウェルに水のクリスタルバイオレットの0.1％溶液125μLを加える。解決しながら手袋と白衣を着用してください。粉体が吸湿性と容易に汚れの衣類、皮膚、等であるとしてCVを計量するときは注意してください
4. 10〜15分間室温でマイクロタイタープレートをインキュベートします。
5. 上記のように水の浴槽に沈めることによって水でプレートを3〜4回​​すすぎ、振ると、すべての余分な細胞と色素のプレートを取り除くためペーパータオルのスタック上に精力的に汚点。
6. 逆さにマイクロタイタープレートを回して、数時間または一晩乾燥させます。
7. 乾燥時に定性的なアッセイでは、井戸を撮影することができます。

3。バイオフィルムの定量化

1. CVを可溶化するマイクロタイタープレートの各ウェルに水に30％酢酸125μLを加える。
2. 10〜15分間室温でマイクロタイタープレートをインキュベートします。
3. 新しい平底マイクロタイター皿に可溶化したCVの125μLを転送する。
4. ブランクとして水に30％酢酸を用いて550nmでプレートリーダーで吸光度を定量化する。

4。代表的な結果：

図1は、。 緑膿菌 、 蛍光菌や黄色ブドウ球菌に対して実行バイオフィルム形成アッセイのための代表的な結果を示しています。 （A）、 緑膿菌のバイオフィルム（8時間、37 ° C）と同様の側面図を。 P.のバイオフィルムと同様の（B）側面図蛍光菌 （6時間、30 ° C）。 S.によって形成されたバイオフィルムの（C）トップダウンビュー平底マイクロタイタープレートの黄色ブドウ球菌 （二つの井戸、24時間、37 ° C）。P.緑膿菌とP.蛍光菌は 、両方の運動性の生物であり、空気-液体界面でのバイオフィルムを形成します。黄色ブドウ球菌は、非運動性であり、井戸の底にバイオフィルムを形成する。

ディスカッション

このメソッドは、微生物種の多様なで使用するように変更することができます。非運動性の微生物は、通常、ウェルの底に付着しながら運動性微生物は、一般的に、壁及び/または井戸の底に付着する。バイオフィルム形成（すなわち、増殖培地、温度、インキュベーションの時間）の最適条件は、それぞれの微生物に対して経験的に決定する必要があります。私はそれぞれの菌株または条件（4-8）のために複製、およびポジティブコントロール、および可能であれば、各プレート上でのネガティブコントロールを含む複数の行うことをお勧めします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 X M63			15gのKH2PO4を溶解させて、5倍濃縮M63ストック溶液として調製します。2PO4, 35g K2高倍率視野4 および10g（NH4)2SO4 1 Lの水に溶解させます。このストック溶...–オートクレーブ処理は不要であり、室温で保存可能です。5倍濃縮ストック溶液を1:5に希釈し、オートクレーブで滅菌して冷却した後、必要な成分を添加してください。
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
K2高倍率視野4	Fisher Scientific	P288-500
(NH4)2SO44)2SO4	Sigma-Aldrich	A5132
硫酸マグネシウム	Fisher Scientific	M63-500	最終濃度が1 mMになるように添加する。水を用いて1 Mのストック溶液を調製し、オートクレーブ滅菌を行う。
グルコース	Fisher Scientific	D16-3	最終濃度が0.2%になるように添加する。水を用いて20%のストック溶液を調製し、オートクレーブ滅菌を行う。
カゼインアミノ酸	BD Biosciences	223050	最終濃度0.5%になるように添加する。水を用いて20%ストック溶液を調製し、オートクレーブ滅菌を行う。
アルギニン	Sigma-Aldrich	A5131	最終濃度0.4%になるように添加する。水を用いて20%のストック溶液を調製し、フィルター滅菌を行う。この代替炭素源/エネルギー源は、グルコースおよびカザミノ酸の代わりに使用できる。
マイクロタイタープレート	BD Biosciences	353911	Falcon 3911, Microtest III, フレキシブルアッセイプレート, 96ウェル, U底, 非滅菌, 非組織培養処理。
マイクロタイタープレート用蓋	BD Biosciences	353913	蓋は、95%エタノール水溶液で洗浄することで再利用可能です。
クリスタルバイオレット	Sigma-Aldrich	229641000	水を用いて0.1%溶液として調製する。