ゼブラフィッシュモデルを用いたマイコバクテリア感染における宿主免疫の役割の評価

要約

出典:Luukinen, H. ほか。Mycobacterium marinum感染の成体ゼブラフィッシュにおける結核のモデル化。 J. Vis. Exp.(2018年)。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 実験的M. marinum感染(腹腔内注射)

1. 希釈した細菌溶液の5μL液滴をパラフィルムフィルムにピペットし、30Gのインスリン針に取り込みます。
2. 実験には5〜8ヶ月の野生型魚とrag1−/−hu1999変異魚を使います。成体のゼブラフィッシュには0.02%の3-アミノベンゾ酸エチルエステル(pH 7.0)で水槽内の麻酔を行います。魚の腹側を上にして湿ったフォームの上のスリットに位置付けます。
   注:ラグ/-変異魚は体細胞組換えを起こし、機能的なT細胞およびB細胞を産生することはできません。
3. 腹びれの間に約45度の角度で針を注射します。針の開口部を上に保ち、開口部全体が腹腔内にあることを確認します。ゆっくりと細菌の懸濁液を注射し、慎重に針を外してください。
   注: 注射時に赤いトレーサーが魚から漏れている場合は、その魚を実験から除外してください。
4. 注入直後、魚を新鮮な水槽の入った回収水槽に移します。
5. 使用中の細菌アリコートから7H10プレートに15分ごとに細菌懸濁液のサンプルを採取し、29°Cで5日間培養し、プレート上のコロニー数で感染量を確認します。
6. 魚の健康状態を定期的に確認し、感染症状のある魚は3-アミノベンゾア酸エチルエステル(pH 7.0)を0.02%以上摂取して安楽死させてください。
   注: 約34±15 CFUに感染した成体のゼブラフィッシュの7%、2029±709 CFUに感染したゼブラフィッシュの30%が8週までに症状を呈しています19。症状には、異常な泳ぎ方、触覚への反応の欠如、息切れ、浮腫、または目に見える消耗感などが含まれます。
7. ゼブラフィッシュは一般的な基準に従って飼育してください

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マイコバクテリウム・マリナム	アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション	ATCC 927
ミドルブロック7H10寒天	BD、サーモフィッシャー・サイエンティフィック	11799042
ミドルブロックOADC濃縮	BD、サーモフィッシャー・サイエンティフィック	11718173
ミドルブロック 7H9 ミディアム	BD、サーモフィッシャー・サイエンティフィック	11753473
ミドルブロックADCエンリッチメント	BD、サーモフィッシャー・サイエンティフィック	11718173
リン酸塩緩衝生理食塩水錠剤(PBS)	シグマ・オルドリッチ	P4417-50TAB
フェノールレッド	シグマ・オルドリッチ	P3532
27G針	ヘンケ・サス・ウルフ	4710004020
1mLシリンジ	ヘンケ・サス・ウルフ	4010.200V0
オムニカン100 30Gインスリン針	ブラウン	9151133
3-アミノベンゾア酸エチルエステル(pH 7.0)	シグマ・オルドリッチ	A5040