組織生検における細菌の癒着を研究するためのin vitro平行プレートフローモデル

要約

出典:Ditkowski, B. ほか。細菌が移植組織に付着する様子を研究するための平行プレート灌流システムのin vitroモデル。 J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、平行板フローチャンバーを用いて蛍光標識細菌を血管移植組織に灌流する方法を示し、せん断流条件下での細菌の付着と早期病因の制御解析を可能にします。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査・承認されています。1.平行板フローチャンバーを用いたin vitro灌流実験

1. 直径10mm、同じ厚さの組織生検をフローチャンバーシステムに取り付け、内側の表面が上向きにして細菌の懸濁液に接触させます。
   注: 異なるグラフトで同じ組織厚を持つことで、チャネル内で同じ組織高さが得られ、あらゆる条件下で層流が可能となります。フローチャンバーのすべての要素は 図1に示され説明されています。
   1. プロトコルを開始するために、円形組織の片を8mm円形穿孔のある顕微鏡スライドとゴム製ガスケットの間に挟みます。
      注: 顕微鏡スライドには8mmの穴を生成できる超薄い底膜が備わっています。ゴムシートと組み合わせて組織を固定し、標本と流動培地の直接接触を可能にするとともに、実験中の生検の脱臼を防ぎます。検査対象組織の表面は流れにさらされている(直径が小さいため)ピンセットでは操作できません。
      1. ティッシュ入りのホルダーをチャンバーの底部金属フレームに埋め込まれたガスケットシートに挿入します。
      2. 上部の金属フレームと対応するガスケットシートを、事前に挿入されたティッシュホルダーでチャンバーの底部に取り付けます。その後、チャンバー全体を8本のネジとネジナットで取り付けます。移植片ごとにチャンバーの高さが常に同じであることを確認してください。
         注: チャンバーの高さはネジを締める際に必ず決めるべきです。キャリパーや定規を使いましょう。
2. フローチャンバーを蠕動ポンプで、流体リザーバーをチューブに接続します。
3. 組織に10⁷ CFU/mL(CFU(コロニー形成単位)カウントおよびOD₆₀₀ (光学密度測定関連)で確認された蛍光標識細菌を、パリスタルティックポンプ(流量4 mL/分)で3ダイネ^/cm² (ダイネ1平方センチメートルあたりの圧力単位)で、400 mLの細菌貯蔵槽(社内設計)を用いて1時間間灌流します。 図1)プレートサーモスタットを用いて37°Cで調整されたもの(材料表)。
4. 同じ収集貯蔵庫で100mLの細菌懸濁液を連続的に循環させます。
5. 灌流後、チャンバーを分解してグラフトを解放し、12ウェルプレート上で4mLのPBSで2回、実験室のオービタルシェーカーで3分間洗浄します。その後、より小さな直径の皮膚生検パンチで移植片の内側を切断しました。
6. 各組織生検を、滅菌0.9%NaClを1mL入った別々の14mLチューブに入れます。チューブは#1とラベルを貼ってください。
7. 超音波洗浄で10分間(振幅=100%、周波数=45kHz)細菌を組織から剥離します。
   注: 組織グラフトからの細菌の完全な剥離は、パッチをTSB(トリプティック大豆ブロス)液体培地で37°Cで一晩インキュベートし、その後OD₆₀₀ 測定を行って、細菌を除去した対照パッチと比較して評価すべきです。

結果

図1: 新たに開発されたフローチャンバーシステムの画像(社内設計)。A.フローチャンバー(1)は、寸法L×W×H:125 mm x 55 mm x 18 mm(ネジとスクリューナットの組み合わせでチャンバーの部品を固定し、金属フレーム を通じて ガスケットに圧力をかけて漏れを防ぐ)(2) 柱の上部;(3) チューブコネクターを固定するための2つの穴を持つ上部ガスケットシートで、これはフローチャンバーとポンプおよび流体リザーバーをチューブシステムを介して接続してい...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
牛心膜(BP)パッチ、サップル心膜ガード	シノビス・サージカル・イノベーションズ、アメリカ	PC-0404SN
牛頸静脈導管(BJV)	コンテグラ導管;メドトロニック社、アメリカ	M333105D001
CHクライオ保存ホモグラフト	欧州ホモグラフト銀行(EHB)	-
アクパンチ	アキューダム社、アメリカ	P850(8 mm);P1050(10mm)
ヒト・アルブミン	フレックスバミン;バクスター、ベルギー	BE171464LOT:16G12C
トリプティック大豆ブロス(TSB)	フルーカ、シュタインハイム、ドイツ	22092-500G
心臓インフュージョンブロス(BHI)	フルーカ	53286-500G
リン酸塩緩衝生塩水(PBS)。	ギブコ	14190-094
5(6)-カルボキシフルオレセインN-ヒドロキシスクシニミドエステル(CF)	シグマ・アルドリッヒ、ドイツ	21878-100MG-F
蠕動ポンプ(モデルISM444B)	イスマテックBVP-Z標準;コール・パーマー(ドイツ、ヴェルトハイム)	631942-2
音響浴	VWR超音波クリーナー、VWR、ラドナー、ペンシルベニア州	142-6044	230V/50 -60Hz 60VA;HF45kHz、30W
プロロング ゴールド アンチフェイド マウント	サーモフィッシャーによるインビトロジェン	P36930
Arium Pro VF - 超純水 - H2O MilliQ	ミリポール	87206462
顕微鏡スライド - 組織培養チャンバー(1ウェル)	サーステット	94.6140.102
Lumoxの1ウェルは着脱可能	サーステット	94.6150.101
ステンレススチール - 手術用ブレード	スワン・モートン	311
タイゴンシリコーンチューブ、1/8インチ内径 x 1/4インチ外径	コール・パーマー	EW-95702-06	温度範囲:–80〜200°C。テリライズ:エチレン酸化物、ガンマ線照射、またはオートクレーブで30分間、圧力15 psiで
PharMed BPTチュービング	サン・ゴバン	AY242012	121°Cで30分の自家焼き保存可能
タイゴン LMT-55 チュービング	サン・ゴバン・パフォーマンス・プラスチックス™	15312022
サーモスタット	BMG BIOMEDIZINTECHNIK	300-0042	230V、90VA、50Hz