カテーテル関連尿路感染症をモデル化するための3Dプリントされたシリコーンコーティングデバイス

要約

源：
オーシャン・E・クラーク¹、ロミー・A・ドップ¹、トム・ハッセル¹、ジョアン・L・フォザーギル¹、ダニエル・R・ニール<sup>2

1</sup>リバプール大学、 ² ダンディー大学

このビデオでは、尿道カテーテルの内面を模倣して、カテーテル関連尿路感染症をシミュレートする 3D プリントされたシリコンコーティングされたデバイスの使用法を示します。

プロトコル

サンプル収集を含むすべての手順は、研究所の IRB ガイドラインに従って実行されています。

1. Flexipegモデルの積層造形

1. ペグ(ペグ蓋あたり24個必要)とペグリッドを、光造形(層高100μm)を用いて高温安定樹脂でプリントします。
   手記： ペグには高温安定樹脂を使用し、ペグ蓋は実験前にオートクレーブ滅菌が可能です。
2. 60%の充填で溶融堆積モデリング(FDM)を使用して、金型コンポーネントと試験管ラックの部品の両方を3Dプリントします。
   手記： 金型や試験管ラックはエタノール滅菌が可能で、高温での安定性を必要としないため、耐久性のある樹脂であれば何でもFDMに適しています。
3. モデル コンポーネントが正しく印刷されていることを確認し、70% エタノールを使用して印刷プロセスから余分な残留物を取り除きます。
4. 図 1 に示すようにシリコン マットの型を組み立て、必要に応じてテープで側面を所定の位置に保持します。

2. Flexipegモデルの準備

1. シリコンマットの準備
   1. 18 gのシリコーンベース(10:1のベースと触媒ポリジメチルシロキサン(PDMS)、縮合硬化)をビーカーに秤量し、よく混ざるまで2 gの触媒を穏やかに混合します。
      手記： 金型内で気泡が形成されるのを防ぐため、シリコン混合物を過度にかき混ぜないでください。
   2. 組み合わせたシリコーン混合物をFDMプリントされた型に注ぎ、型の側面と上部から余分なシリコーン混合物を拭き取ります。室温(RT)で一晩(最低18時間)硬化させます。
   3. 型からマットを取り外し、側面から余分なシリコンを切り取ります。 図1に示すように、マットがペグの蓋に収まることを確認します。
2. ペグコーティング
   1. ペグをシリコンマット(マットあたり24ペグ)に挿入し、テープを使用してマットをペグの蓋またはマットと同様の寸法のプラスチックトレイに固定します。
   2. 27 gのシリコーンベースを浅いプラスチックトレイ(96ウェルプレートとほぼ同じ寸法)に秤量し、よく混ざるまで3 gの触媒を完全に混合します。
   3. ペグの蓋を裏返してペグが下を向くようにし、すぐにペグをシリコン混合物に浸します。ペグの蓋を裏返し、余分なシリコンがペグに滴り落ち、ペグが室温で一晩硬化します。
      手記： 速硬化シリコーン(6〜8時間の完全硬化、40〜60分の作業時間)は、硬化前に滴り落ち/流れ続けます。したがって、過剰になると硬化中にペグの残りの部分がコーティングされるため、浸漬時にペグ全体をPDMSでコーティングする必要はありません。
   4. 硬化したら、手順2.2.2から2.2.3を繰り返します。ペグがPDMSで3回コーティングされるまで。2 番目のコーティング ステップに進む前に、最初のコーティング層が完全に硬化していることを確認してください。
      手記： 最終的なペグコーティングは、目に見える欠陥がなく、厚さ<2mmである必要があります。RTで一晩インキュベートした後もシリコーンが粘着性のままである場合は、24時間硬化させ、ペグがまだ触ると粘着性がある場合はコーティングを廃棄します。
   5. 滅菌メスを使用して、シリコンでコーティングされたペグの基部の周りをトリミングし(できるだけ底に近づけて)、コーティングセットアップからペグを取り外します。
      手記： このプロセスは、必要な数のペグとシリコンマットが準備されるまで繰り返す必要があります。ペグコーティングプロセスで使用される余剰のPDMSは、硬化前に新しいシリコンマットを鋳造するために使用できます。
3. モデル設定
   1. コーティングされたペグをシリコンマットに挿入し、 図1に示すように、マットをペグの蓋に固定します。
   2. ペグの蓋/シリコンマット(ペグベースに取り付けられている)の下側をオートクレーブ可能なテープで覆い、ペグを所定の位置に保持します。ペグの蓋のセットアップを密封されたオートクレーブ可能なバッグに入れ、使用前にオートクレーブ滅菌します。
      手記： ペグ蓋のペグは、96ウェルプレートに1つの単一の方向で収まります。ペグセットアップをテープで留めた後、予備の96ウェルプレート内のペグの位置合わせを確認し、それに応じてオートクレーブテープに正しい蓋の向きでラベルを付けます。

3. モデルの接種

1. 細菌培養の調製
   1. 固体培地で増殖した細菌コロニーのループフルを10 mLのLuria-Bertani(LB)ブロスに懸濁することにより、試験中の細菌分離株の一晩培養を調製します。攪拌しながら37°Cで一晩(18時間)インキュベートします。
      手記： Flexipegバイオフィルムモデルでの使用には、少なくとも3つの生物学的複製が推奨されます。
   2. 1 mLの最終容量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で、培養物を0.1のOD_600nm(プレート希釈後の約10⁸ コロニー形成単位(CFU)/ mL)に正規化します。
2. マイクロプレートのセットアップと接種
   1. 図1(8)のプレートレイアウトに従って、プールされたヒト尿(PHU)135 μLを96ウェルプレートの各オンテストウェルに分注します。各ウェルは1つの技術的複製を表します(生物学的複製ごとに最低n = 3つの技術的複製が必要です)。
      手記： ユーザーが希望する場合は、PHU の代わりに人工尿媒体 (AUM) を使用できます。
   2. 各オンテストウェルに15 μLの正規化オーバーナイト培養を接種し、最終ウェル容量を150 μLにします。接種物のCFU/mLを検証するために、少なくとも100 μLの正規化オーバーナイト培養を連続希釈用に予約します。
   3. 150 μLの滅菌PHUを関連するウェルにのみ分注して、ネガティブコントロールを調製します。
   4. マイクロプレートのセットアップに続いて、ペグをそれぞれのウェルに挿入し(ペグのオートクレーブ滅菌前に決定)、ペグの蓋がプレートの表面と同じ高さであることを確認します。ペグの蓋をマイクロプレートの蓋で覆い、必要に応じてオートクレーブテープで所定の位置に保持します。
   5. ペグモデルを、蒸発を防ぐために湿らせた青いロールで密閉されたプラスチック製の浴槽/袋に入れ、37°Cで24時間静的にインキュベートします。
3. 接種物の検証
   1. 180 μLのPBSを96ウェルマイクロプレートの最初の列の2〜6行目に分注し、予約した100 μLの正規化された一晩培養を最初のウェルに加えます。
   2. 正規化された一晩培養物20 μLを最初のウェルから取り出し、2番目のウェルにアリコートし、穏やかに上下にピペッティングして混合します。
   3. 最初の接種物が最終ウェル(1 × 10⁵)まで希釈されるまで、ステップ3.3.2を繰り返します。
   4. 各希釈液の10 μLスポットを適切な固体培地に3回にプレートします。37°Cで静的に一晩インキュベートします。
   5. インキュベーション後、各スポットのコロニー数を数えて、接種物の実際のCFU / mLを計算します。

4. バイオフィルムの定量化

1. ペグ加工
   1. インキュベーション後、ペグモデルをマイクロプレートから取り外し、炎下または微生物安全キャビネット内(ペグを上に向けて)で反転させます。マイクロプレートは廃棄します。
   2. ペグ蓋を180 μLの滅菌PBSアリコートを含む新しいマイクロプレートに移し、接着していない細胞を除去します。新鮮なPBSで2回繰り返し、合計3つの洗浄ステップを行います。
      手記： 表面関連バイオフィルムへの損傷を防ぐために、各マイクロプレートからペグの蓋を取り外すとき(つまり、ウェルの端に触れるとき)にペグを乱さないようにしてください。
2. CFU/mL 計数 (バイオフィルム関連)
   1. 炎下または微生物安全キャビネット内で無菌状態で作業し、 図1に示すようにチューブラック(ステップ1.2で製造)を滅菌ガラス試験管でセットアップし、ペグの蓋にフィットするラックトップを取り付けます。
   2. 無菌状態で、600 μLの滅菌PBSを各試験管に分注します。
   3. ペグの蓋をラックに置き、ペグをラック内のチューブと一直線に合わせます。ペグ蓋のオートクレーブテープをすべて剥がします。
   4. 滅菌鉗子を使用して、ペグをペグの蓋を通して、下に整列した対応する試験管に押し込みます。
   5. チューブの蓋を元に戻し、各チューブを60秒間渦巻きさせて、バイオフィルム関連細胞をペグ表面から分解します。
   6. 各チューブから100 μLを取り出し、前述のステップ3.3で説明したように、滅菌PBSで連続希釈します。
   7. 血清学的ピペットプレートを使用して、適切な固体培地上に各希釈液の10 μLスポットを置き、37°Cで一晩静的にインキュベートします。
   8. インキュベーション後、各希釈プレート上のコロニー数を数え、それを使用してCFU / mLを計算します。
3. クリスタルバイオレット染色
   1. 180 μLの0.1%(w / v)クリスタルバイオレット(滅菌水中)を96ウェルマイクロプレートの24個のオンテストウェルに分注します。
   2. すすぎたペグモデル(ペグとペグの蓋)をマイクロプレートの対応するウェルに挿入します。室温で20分間静的にインキュベートします。
   3. インキュベーション後、ペグモデルをマイクロプレートから取り外し、マイクロプレートを廃棄します。
   4. 適切なサイズの浴槽で、水道水で設置したペグ全体を軽くかき混ぜながらすすぎます。3回繰り返します。
   5. ペグモデルを反転させ、ペグをRTで完全に乾燥させます。
   6. 180 μLの30%酢酸を新鮮な96ウェルマイクロプレートに分注し、乾燥したペグモデルを対応するウェルに挿入します。RTで30分間インキュベートします。
   7. マイクロプレートからペグモデルを取り外し、マイクロプレートリーダーまたは分光光度計を使用して染色ウェルの外径_540nm を読み取ります。
   8. ペグ上のバイオフィルム形成を計算するには、染色されたネガティブコントロールペグのOD_540nm を平均し、テスト上のペグの平均から差し引きます。

結果

図1:Flexipegモデルセットアップの概略図。(1) バイオフィルム形成のために尿道カテーテル表面を複製するためにポリジメチルシロキサン (PDMS) でコーティングされた単一のフレキシペグ。(2) Flexipeg バイオフィルム デバイスは、(3) 個々のペグを所定の位置に保持するシリコン マットと、(4) 96 ウェル プレートに適合する蓋で構成されています。コンポーネントは、

高温樹脂を用いた光造形(層高100μm)(5)ペグを下流のコロニー形成ユニット...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルマイクロプレート	グライナー	650161	U字型/丸底。
酢酸	SLSの	695092-2.5LSIG	≥ 99.7% ACS 試薬。
クリスタルバイオレット	メルク	61135-25G
個別ペグ	社内	3DプリントするFlexipegコンポーネント	高温安定樹脂を使用した積層造形(Flexipegモデルごとに24ペグが必要)。Protolabs (NL) の Formlabs 高温樹脂を使用して製造されています。
ルリア・ベルタニ(LB)ブロス	ネオジェン	NCM0088B	LBブロス(ミラー)。
96ウェルプレートにフィットする蓋	社内	3DプリントするFlexipegコンポーネント	高温安定樹脂を用いた積層造形
シリコンマットを用意する型	社内	3DプリントするFlexipegコンポーネント	あらゆる耐久性のある素材からの積層造形。Protolabs(NL)のABSプロトタイピング樹脂を使用して製造されています。
シリコンマット面を用意する金型	社内	3DプリントするFlexipegコンポーネント	あらゆる耐久性のある素材からの積層造形。
リン酸緩衝生理食塩水	メルク	P4417-50タブ
プールされた人間の尿	-	-	中央大学研究倫理委員会による倫理的承認を受けて、健康なドナーから収集されます。
ガラス管用ラック	社内	3DプリントするFlexipegコンポーネント	あらゆる耐久性のある素材からの積層造形。
シリコーン(PDMS)	MBグラスファイバー	GP3481-F	Polycraft汎用RTV凝縮硬化型製造シリコーンゴム
ペグ蓋にフィットするトップス	社内	3DプリントするFlexipegコンポーネント	高温安定樹脂を用いた積層造形
フォーリーカテーテル	グレートベアヘルスケアUK株式会社		14チャンネル、100%シリコン